葛根素对胃蛋白酶部分性质的影响

考察葛根素对胃蛋白酶的抑制作用,并通过紫外光谱法和荧光光谱法研究葛根素与胃蛋白酶的结合方式。以1/v对抑制剂量用Dixon作图法得出ki值为0.51×103mol/L,抑制剂类型为非竞争性抑制。葛根素与胃蛋白酶分子结合形成稳定缔合物,从而改变后者分子构象,使胃蛋白酶的紫外吸收差谱迅速增强,特征荧光峰产生静态淬灭。     

PLAC1特异性TCR基因修饰T细胞对乳腺癌的抗肿瘤作用

目的研究胎盘特异性基因1（PLAC1）特异性T细胞受体（TCR）基因修饰T细胞对乳腺癌的抗肿瘤作用。 方法磁珠分选人类白细胞抗原分型为A2（HLA-A2）的志愿者外周血单个核细胞（PBMC）中的CD8⁺ T细胞,流式检测CD8⁺ T细胞的表型。通过慢病毒载体构建、包装,将可识别乳腺癌肿瘤抗原PLAC1的HLA-A2限制性的TCR基因导入CD8⁺ T细胞（称为TCR-T细胞）,以慢病毒空载体包装、感染的CD8⁺ T细胞（NC-T细胞）作为对照细胞,通过流式细胞术检测PLAC1特异性TCR的表达效率。免疫荧光和流式细胞术检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231（三阴性乳腺癌细胞）的PLAC1和HLA-A2血清型的表达。WST-1法检测不同效靶比（5?:?1、10?:?1和20?:?1）TCR-T细胞或NC-T细胞与乳腺癌细胞MCF-7或MDA-MB-231作用后的细胞毒性,并通过ELISA检测共培养后T细胞IFN-γ的释放量。通过裸鼠皮下人乳腺癌移植瘤模型检测TCR-T细胞以及NC-T细胞的抗肿瘤作用。采用单因素方差分析及独立t检验进行统计学分析。 结果磁珠分选出的CD8⁺ T细胞CD3⁺ CD8⁺比例达到（98.89±0.30）%。经慢病毒感染、五聚体检测,TCR-T细胞中PLAC1特异性TCR的正确表达率为（24.58±0.82）%,NC-T细胞不表达PLAC1特异性TCR。免疫荧光和流式结果显示乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231为HLA-A2和PLAC1双阳性表达细胞。其中流式检测结果显示,MCF-7和MDA-MB-231细胞中HLA-A2的表达效率分别为（93.04±1.36）%和（98.72±0.12）%。在效靶比为20?:?1时,TCR-T细胞对MCF-7杀伤率为（51.5±1.37）%,高于NC-T细胞对MCF-7的杀伤率（5.93±2.40）%,t = 15.507,P < 0.01;TCR-T细胞对MDA-MB-231杀伤率为（44.34±2.20）%,高于NC-T细胞对MDA-MB-231杀伤率（5.15±2.40）% （t?= 10.694,P < 0.01）。在相同效靶比情况下,TCR-T细胞对MCF-7或MDA-MB-231细胞的细胞毒性高于NC-T细胞,且随着效靶比的增加杀伤效果增强。在效靶比为20?:?1时,与MCF-7共培养后TCR-T细胞IFN-γ的分泌水平[（347.49±4.10）pg/ml]高于NC-T细胞[（18.14±6.22）pg/ml]（t = -76.638,P < 0.01）;与MDA-MB-231共培养后TCR-T细胞IFN-γ的分泌水平为（255.25±6.85）pg/ml,高于NC-T细胞[（14.70±6.38）pg/ml] （t = -44.526,P < 0.01）,且随着效靶比的增加分泌量升高。在裸鼠皮下人乳腺癌移植瘤实验中,生理盐水组和NC-T细胞移植组小鼠的肿瘤生长迅速,TCR-T细胞治疗组小鼠肿瘤生长相对缓慢,在移植后第35天,生理盐水组、NC-T细胞组和TCR-T细胞组小鼠肿瘤的平均体积分别为（5?636.96±2?879.55）mm³、（5?522.12±3?391.48）mm³和（1?403.85±1?394.31）mm³,TCR-T细胞治疗组小鼠肿瘤体积明显小于生理盐水组（F = 0.1813,P < 0.05）和NC-T细胞组（F = 0.1307,P?< 0.05）。 结论PLAC1特异性TCR基因修饰T细胞对乳腺癌细胞具有较强的抗肿瘤作用,PLAC1可作为乳腺癌治疗的潜在靶标;PLAC1特异性TCR基因修饰T细胞治疗是PLAC1表达阳性的乳腺癌治疗的新策略。     

丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶与DNA损伤应答

DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)是维持基因组稳定性的核心机制,对DDR的研究不仅有助于阐明癌症发生发展的机理,同时也为癌症治疗和抗癌新药开发提供生物学基础。蛋白质翻译后修饰,尤其是蛋白激酶介导的磷酸化修饰和蛋白磷酸酶介导的去磷酸化修饰,参与调控绝大多数的生命活动过程,包括DDR。对蛋白激酶ATM/ATR/CHK2/CHK1介导的DDR的研究已经比较透彻,但是对蛋白磷酸酶在DDR中的功能研究还有待加强和深入。比较全面地综述丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶在DDR中的功能并探讨在抗癌新药开发中的前景。     

光照与温度对拟南芥tak基因表达与LHC磷酸化的影响

TAK1和TAK2是拟南芥核基因编码的蛋白激酶,TAK1可能参与植物状态转换中LHCⅡ蛋白磷酸化的调控.根据TAK1蛋白序列,合成了一段含12个氨基酸残基的亲水短肽,与牛血清白蛋白(BSA)偶联并免疫家兔得到TAK1抗体.经免疫双扩散和蛋白质印迹检测,该多肽抗体效价和特异性较高.借助TAK1抗体以及磷酸化抗体进行杂交试验,结合特异引物进行半定量PCR,研究了光照与温度对拟南芥tak1和tak2基因表达的影响.结果表明,光强与温度调节LHCⅡ蛋白磷酸化,也会在转录水平和蛋白质水平上影响tak1和tak2基因表达.LHCⅡ蛋白磷酸化对光响应趋势与TAK1蛋白水平变化相同.此外,低光照促进tak2基因表达,tak2基因转录表达受温度的影响较小.tak1和tak2基因表达调控方式不同,可能与启动子响应元件的不同相关.     

重组GST-HBx蛋白在表达过程中断裂状况的研究

目的 在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法 以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列（1～154氨基酸）和截短序列（48～104氨基酸,48～146氨基酸,98～146氨基酸）,将这几种不同长度和位置的HBX DNA序列克隆到pGEX4T-2原核表达载体中,并通过下游引物设计中引入6×组氨酸标签序列.结果 最终成功构建N端融合GST蛋白标签序列和C端融合6×组氨酸标签序列的4种HBx重组表达载体.将4种包含不同长度HBx的重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta,培养至菌液浓度A值大约0.6左右,加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.提取全菌蛋白通过Western印迹对HBx各重组蛋白产物的N端和C端进行检测.结论 在分段表达的HBx重组蛋白中发生了多处局部的断裂,而断裂部位主要集中于GST蛋白上.而造成这一结果的原因可能与HBx蛋白功能区域暴露后与GST相互作用有关.     

干扰素在肝癌细胞Huh7.0中诱导SAMHD1抑制HBV复制

目的:研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法:首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7. 0细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平;进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1,再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应;最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果:在Huh7. 0细胞中,SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高;干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失; SAMHD1定位在细胞核内,干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内,缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论:在Huh7细胞中,干扰素α、β能诱导SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制,SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。     

基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1肝癌细胞系的构建及对增殖的影响

运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立SAMHD1基因敲除的Huh7细胞系,并检测敲除SAMHD1基因后对人肝癌细胞Huh7细胞增殖的影响.针对SAMHD1基因作用的功能区域,设计靶向SAMHD1的小向导sgRNA(Small Guide RNA).构建lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA重组质粒转化后测序.筛选稳定敲除SAMHD1的稳定细胞系并测序鉴定.采用克隆形成实验分析基因SAMHD1敲除后肝癌细胞Huh7细胞的增殖能力.测序结果显示lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA载体构建成功.Western blot结果和测序结果表明成功构建敲除SAMHD1的Huh7稳定细胞系.克隆形成实验结果表明,相对于Huh7-WT细胞,Huh7-KO SA-MHD1的细胞增殖能力增强(P＜0.01).成功构建基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1基因的Huh7细胞系,SAMHD1的表达缺失促进肝癌细胞的增殖.     

APOBEC3A通过脱氨基作用抑制HBV复制

目的:研究APOBEC3A抑制HBV复制的分子机制。方法:首先在肝癌细胞HuH7中过表达APOBEC3A,通过MTT法检测了APOBEC3A对细胞毒性的影响;通过免疫荧光检测了APOBEC3A在细胞中的定位,通过IP试验进一步证实了APOBEC3A与病毒颗粒的相互作用;并通过ELISA,特异性荧光定量PCR检测了HBV复制的参数包括上清中HBsAg,病毒核心颗粒中HBV DNA以及核内的cccDNA的表达水平;最后通过3D PCR方法分析了核心颗粒中HBV DNA脱氨基作用。结果:过表达APOBEC3A对HuH7细胞毒性没有显著性差异;APOBEC3A主要位于细胞核,但APOBEC3A可以与病毒颗粒结合,在逆转录环节对HBV复制发生抑制作用;共转染HBV复制质粒和APOBEC3A表达质粒后,细胞上清中HBsAg,核心颗粒中的HBV DNA以及核内的cccDNA均显著下降;最后通过3D PCR和克隆测序表明核心颗粒中的HBV DNA负链发生了大量的G-A突变,同时正链也发生了较多的C-T突变。结论:APOBEC3A可与病毒颗粒结合,在HBV复制的逆转录环节可作用于HBV单链,发生脱氨基作用,从而抑制HBV的复制。     

反向斑点杂交法快速检测HBV基因型反应条件的优化和建立*

利用反向斑点杂交技术,设计出特异性基因分型探针,并将探针固定在带正电荷的尼龙膜上,与PCR扩增带有地高辛标记的临床血清样本进行杂交。通过优化杂交反应条件,建立起简单、快速、特异地检测HBV基因型的方法。利用该方法对重庆地区临床样本进行分型检测,并与直接测序结果比较。结果表明新建的HBV基因分型方法可对拷贝数在103以上的血清样本准确分型,特异性达到96.67%。重庆地区感染HBV主要以B型为主。     

多聚嘧啶序列结合蛋白（PTB）与HBV转录后调节元件（HPRE）结合抑制HBV表面抗原的基因表达

采用RT-PCR验证PTB与HPRE在体外的特异性结合。用HepG2.2.15细胞系、HBs-HPRE瞬时转染Hela细胞探讨PTB对HBV基因表达的影响。结果显示PTB能与HPRE特异性地结合。功能性研究证明PTB可以抑制HepG2.2.15细胞的HBsAg表达量,并呈浓度依赖性。由HPRE引起的HBsAg表达的增加也能被PTB所抑制。实验数据证明PTB通过与HPRE相互作用抑制HBsAg的基因表达。