小鼠卵ZP3蛋白的可溶性表达、纯化及免疫活性鉴定

哺乳动物卵透明带3(Zona pellucida 3,ZP3)在诱导获能精子发生顶体反应中发挥着重要作用,其在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达。本研究在大肠杆菌中诱导表达可溶性的mZP3融合蛋白,并鉴定该蛋白的免疫活性。将小鼠卵透明带3克隆至pMAL-p2x质粒,转化至大肠杆菌BL21表达菌中。用不同温度、不同IPTG浓度、不同诱导时间及不同浓度的添加剂诱导目的蛋白表达,以筛选出mZP3融合蛋白可溶性表达的最佳条件。大量表达纯化后以Western blotting和ELISA检测蛋白的免疫活性。酶切鉴定及DNA测序表明mZP3已克隆入pMAL-p2x质粒。经优化诱导表达条件,筛选出mZP3融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时添加0.02 mol/L葡萄糖,以0.6 mmol/L IPTG于25oC条件下诱导表达4 h。ELISA及Western blotting检测结果表明诱导表达的蛋白具有免疫活性。在大肠杆菌中表达并纯化获得可溶性mZP3蛋白,为mZP3免疫不育疫苗研制及其免疫效果检测提供了可溶性抗原。     

鼠卵透明带3在Pichia pastoris酵母中的分泌表达

本研究通过酵母Pichiapastoris表达鼠卵透明带 3(mZP3)蛋白 ,获得控制害鼠生育研究的抗原物质。根据国际基因库已发表的mZP3基因序列设计引物 ,并分别在 5’引物和 3’引物中引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增 ,将mZP3克隆至穿梭质粒pGAPZαA上 ,获得的重组穿梭质粒pGAPZαA mZP3经线性化后 ,采用LiCl法转入毕赤酵母SMD1 1 68菌株中 ,Zeocin+ 筛选阳性克隆 ,酵母发酵上清液进行SDS PAGE和Western blot检测 ,结果表明mZP3在酵母中得到了特异性表达 ,表达产物的分子量约为 60kDa ,说明mZP3能够在酵母真核系统中成功表达 ,并可以用作mZP3免疫不育控制鼠害的检测抗原。     

犬卵透明带3蛋白原核表达和抗血清的制备

在研发控制流浪犬卵透明带3(CZP3)免疫不育疫苗的过程中,需要制备特异性的CZP3抗血清进行免疫检测。本研究克隆获得CZP3的c DNA(全长1 281 bp)和除去跨膜区和信号肽的核心片段(CZP3C,984 bp),通过构建原核表达载体p ET28a-CZP3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)。在28℃下以0.6 mmol·L~(-1)异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导表达4 h,获得CZP3C融合蛋白。利用CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备特异性的抗血清,并对抗血清的特异性和效价进行评价。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白以包涵体形式存在。经过镍柱亲和纯化及8 mmol·L~(-1)尿素复性后,获得了高纯度的CZP3C融合蛋白。用0.8μg·μL~(-1)的CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,免疫后的兔抗血清用Western blot及间接免疫荧光实验检测,结果证明CZP3C兔抗血清具有较高的特异性,ELISA检测效价为1∶409600。本研究所制备的抗血清能够为流浪犬免疫不育疫苗的研制提供检测材料。     

草原兔尾鼠卵透明带3基因原核表达条件的优化

目的：通过大肠杆菌原核表达系统制备草原兔尾鼠卵透明带3（LZP3）融合蛋白,作为草原兔尾鼠疫苗免疫抗生育研究的抗原物质。方法：将LZP3基因的核心片段构建到融合表达载体pGEX-4T-1K中GST的3’端,形成GST-LZP3融合基因,经本科切鉴定和序列分析证实基因序列的正确性。在不同温度,不同时间和不同IPTG浓度进行诱导后,用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,发现有一条分子量约63kD的新增蛋白条带。结果：研究表明在37℃,25℃的不同温度条件下均能诱导出LZP3蛋白,经SDS-PAGE和间接ELISA法检测,初步证明了LZP3基因能够在大肠杆菌中有效表达可溶性的融合蛋白。结论：获得了LZP3融合蛋白表达的最佳诱导条件,为大量诱导产生LZP3融合蛋白奠定了理论基础。     

基于密码子优化策略的斑马鱼FOXP3A分子的原核表达及多克隆抗血清制备

目的:构建斑马鱼FOXP3A融合蛋白的原核表达系统,诱导表达并制备多克隆抗血清。方法:选取斑马鱼foxp3a基因cDNA的894 bp特异区段(s-foxp3a),对该片段进行密码子优化后构建原核表达载体pET-32a-s-foxp3a,转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白并纯化,纯化后的蛋白免疫家兔,制备斑马鱼FOXP3A蛋白的多克隆抗血清,4次免疫后取血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果:在16℃经0.5 mmol/LIPTG诱导10 h的条件下,SDS-PAGE分析表明斑马鱼S-FOXP3A-His融合蛋白以包涵体形式产生;间接ELISA检测结果显示,FOXP3A蛋白多克隆抗血清的效价在1.6×10~5以上。结论:制备了高效价的斑马鱼FOXP3A多克隆抗血清,为进一步解析斑马鱼FOXP3A蛋白的功能提供了基础工具。     

重组猪卵透明带-3α抗原及其抗体的制备

目的:制备重组猪卵透明带-3α(rpZP3α)抗原及其抗体供发展避孕疫苗研究。方法:在2L发酵罐中接种毕赤酵母GS115-pZP3α工程菌,高密度发酵表达rpZP3α蛋白,表达的蛋白经螯合镍离子的亲和柱纯化后,用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,以Quantity One软件对rpZP3α进行定量分析。rpZP3α免疫家兔,间接免疫荧光法检测抗血清对rpZP3α和猪卵透明带的抗体反应。IVF试验体外检测抗rpZP3α抗体对猪、小鼠精卵结合的影响作用。结果:工程菌高密度发酵产物经分离纯化后获得能与抗pZP3抗体反应的46kD成分,平均产量为8mg/L,用其免疫家兔获得抗rpZP3α抗血清,间接免疫荧光法分析显示此抗血清能与猪卵透明带反应,产生亮绿荧光。体外精卵结合试验中,随着兔抗rpZP3α抗血清浓度的加大,其对猪、鼠精卵结合的抑制作用也增强。ELISA结果显示抗rpZP3α抗体与rpZP3α蛋白以及天然pZP3蛋白两种抗原反应的强度和趋势基本一致。结论:通过酵母体系制备的rpZP3α及其抗体具有免疫学活性。     

中华大蟾蜍重组Gal-3C的原核表达、纯化及抗血清制备

半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)与肿瘤的发生发展密切相关,已有文献表明其羧基端galectin-3C(Gal-3C)具有一定的肿瘤抑制作用。为了获得Gal-3C的抗血清,实验以已有的重组质粒pGM-Gal-3为模板,利用PCR方法扩增中华大蟾蜍Gal-3C基因片段,并将其插入到表达载体pET28b上,构建中华大蟾蜍Gal-3C的原核表达载体pET28b-Gal-3C;将构建好的重组质粒pET28b-Gal-3C转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质表达,并通过SDS-PAGE和Western-blot检测目的蛋白Gal-3C的表达;以纯化的重组蛋白Gal-3C免疫小白鼠,制备鼠抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清,用Western-blot检测抗血清的特异性及其效价。结果显示成功构建了中华大蟾蜍pET28b-Gal-3C重组质粒,并诱导得到了目的蛋白的表达,而且将表达产物免疫小鼠后获得了特异性良好的抗中华大蟾蜍Gal-3C的抗血清。以上结果为抗肿瘤药物的研究和发展奠定了基础。     

小鼠Foxp3片段的表达和多克隆抗体的制备

克隆了小鼠Foxp3片段,采用基因重组方法,构建重组表达载体pGEX4T1Foxp3。应用在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导产生的GSTFoxp3融合蛋白免疫家兔,制备兔抗Foxp3多克隆抗体。经过ELISA检测,抗血清的效价达1∶128000;采用Westernblot检测,转染Foxp3MIGR载体的Ψam细胞中表达Foxp3蛋白,而仅转染MIGR空载体的Ψam细胞中为阴性表达,表眀抗体具有特异性。     

香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白(NSP)的纯化及抗血清制备

本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E.coli BL21(DE3)为材料,于25℃、0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,集菌后超声波破碎,获得以包涵体形式表达的约20 kD的融合蛋白.实验结果表明,将沉淀的融合蛋白溶于含6 mol/L尿素的Binding Buffer中,再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,可获得高纯度的融合蛋白.将纯化融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳,切胶回收目的带,液氮研磨并按1:1(W/V)混合佐剂,4次免疫家兔,获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清.以融合蛋白作抗原,间接ELISA法测定其抗血清效价为1:5 000.田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1:500.Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合.本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础.     

荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测

目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8 h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8 h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上。结论利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。     

精子发生相关基因片段CG14的克隆及其蛋白的表达

为研究与精子发生相关的基因并探讨其功能 ,用差异显示法发现了 1个与精子发生相关的基因片段CG14 .将该基因片段克隆到表达载体pGEX 3X上 ,在大肠杆菌中表达了融合蛋白 .通过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和柱纯化该融合蛋白 .经Xa因子酶切后Western印迹方法证明 ,靶蛋白分子量约为 8kD ,与预期分子量相符 .用融合蛋白免疫家兔获得抗血清 .免疫印迹实验表明 ,血清中含有CG14蛋白的特异性抗体 ,为进一步研究CG14基因及其表达蛋白的功能打下基础     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

Expression and partial purification of human prolactin in Escherichia coli

1. Human prolactin has been expressed in Escherichia coli. A cDNA fragment coding for the signal sequence and the full length prolactin molecule was cloned into the expression vector pUR291 which directs the synthesis of a beta-galactosidase prolactin fusion protein when expressed in E. coli. 2. Cultures of E. coli harbouring the recombinant plasmid pJMBG62 produced a fusion protein of the appropriate molecular weight which was detected by Western blot analysis using a polyclonal antibody raised against pituitary-derived human prolactin. 3. The fusion protein was isolated from inclusion bodies in a partially pure form and it was used as immunogen to raise antibodies against human prolactin. 4. When this partially purified fusion protein was injected into rabbits it generated antisera with good prolactin titres in animals which were rested for one year following a disappointing primary immunization with purified human prolactin.     

重组人白细胞介素15融合蛋白的表达、纯化及免疫原性检测

目的:以白细胞介素15(IL-15)为靶点,研制类风湿性关节炎免疫治疗蛋白疫苗。方法:将N端融合破伤风类毒素(TT)表位的人IL-15基因克隆至带有His标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,获得重组人TT-IL-15融合蛋白(简称rtIL-15);目的蛋白经镍柱亲和层析纯化后,用Western印迹和HPLC进行鉴定;将rtIL-15与氢氧化铝佐剂混合,免疫BALB/c小鼠,检测疫苗的免疫原性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定结果表明重组融合表达质粒pQE-30-TT-IL-15构建正确,重组蛋白的表达量达到菌体总蛋白的20%,主要以包涵体形式表达,经过纯化、复性后,目的蛋白纯度达到95%以上;蛋白疫苗免疫小鼠后,能诱导高滴度的特异性的IL-15抗体。结论:在大肠杆菌中表达了重组人IL-15融合蛋白疫苗,并具有良好的免疫原性。     

抗MRP3单链抗体-sTRAIL融合蛋白诱导U251多形性胶质母细胞瘤凋亡

采用重组PCR技术获得抗多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3, MRP3)的单链抗体(scFv)与人源可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(soluble TNF-related apoptosis inducing ligand, sTRAIL)的融合蛋白质的基因编码序列, 利用原核表达载体pMAL-c2,构建含麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)标签肽的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白, 经亲和层析柱纯化. 获得纯化的antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白,用MRP3阳性U251多形性胶质母细胞瘤做增殖抑制实验、细胞凋亡诱导实验,结果均显示具有明显的活性, 而MBP无明显作用. 上述结果表明,成功表达了antiMRP3(scFv)-sTRAIL融合蛋白, 该融合蛋白具有诱导U251多形性胶质母细胞瘤细胞凋亡的活性, 为开发靶向性抗肿瘤药物奠定了基础.     

SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8的原核表达

以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。     

绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备

用PCR扩增出绿色荧光蛋白(GFP)基因,插入到pGEX-KG表达载体中,并将构建出的重组质粒命名为pKG- GFP。将重组载体导入大肠杆菌DH10β中,经IPTG诱导产生GST-GFP融合蛋白,同时以可溶蛋白和包涵体两种形式存在。 GST-GFP分子量大约为53kDa,与其理论值大小一致,用亲和层析以及凝血酶处理纯化GFP。纯化的产物经证实具有很好的 均一性。以GFP免疫新西兰家兔,制备多克隆抗体,Westernblotting测定抗血清效价。     

水稻条叶枯病毒基因产物在水稻和昆虫体内的Western印迹分析

将AStV基因组组分3编码的NS3和NC蛋白基因以及组分4编码的NCP和NSvc4蛋白基因分别克隆于大肠杆菌表达载体pGEX3X在IPTG诱导下,表达出4种融合蛋白。这些表达产物用于免疫动物产生多克隆抗血清。以制备的多克隆抗血清为探针,Western印迹分析了宿主植物和介体昆虫体内NS3、NC、NCP和NSvc4种基因表达的产物。NC蛋白的抗体可在病株和病毒粒子制备物中以及NCP抗血清仅在病株中检测到相应大小的产物,其余的均与预期值相停。