重组质粒pcDNA3-dnaJ/蛋白DnaJ异源免疫诱导Th1和Th17细胞免疫应答抵抗肺炎链球菌感染 *

目的 探索更有效的肺炎链球菌DNA疫苗和疫苗免疫策略,并探究其中的保护机制。方法 构建重组质粒pcDNA3-dnaJ并表达DnaJ蛋白,实验分别设置重组质粒pcDNA3-dnaJ/蛋白DnaJ免疫小鼠组及单独质粒pcDNA3-dnaJ免疫小鼠组,分别比较肺炎链球菌菌株攻毒后小鼠鼻腔灌洗液细菌载量及生存率,采用ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价及炎症因子,流式细胞术分析体外BMDCs激活情况及Th1和Th17细胞免疫应答。结果 质粒pcDNA3-dnaJ免疫3次可诱导血清中抗原特异性抗体的产生,并减少肺炎链球菌攻毒后鼻咽部的细菌载量,但在防止致死性感染方面效果较差。然而,与重复质粒DNA接种三次相比,pcDNA3-dnaJ 1次/ DnaJ蛋白加强1次的免疫策略可以显著减少鼻咽中的肺炎链球菌定植,并能够更好的预防致死性感染。此外,与DNA质粒加强免疫相比,DnaJ蛋白加强免疫后可产生更高水平的IFN-γ和IL-17A。结论 重组质粒pcDNA3-dnaJ/蛋白DnaJ异源免疫可能通过活化树突状细胞,进而诱导Th1和Th17细胞免疫应答,抵抗肺炎链球菌感染。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B6多克隆抗体的制备

利用核酸免疫蛋白加强法制备兔抗棉铃虫CYP6B6的多克隆抗体。构建重组质粒pcDNA3-CYP6B6并测序验证序列的正确性后,采用皮下多点注射法将重组质粒注射到新西兰大白兔体内,免疫3次后,第4次使用融合蛋白MBP-CYP6B6加强免疫。用ELISA法检测抗体的效价,并利用免疫组化法对抗体的特异性进行检测,得到的兔抗CYP6B6血清的效价达到1︰50 000。免疫组化法检测显示此抗血清能与棉铃虫不同组织中存在的CYP6B6蛋白特异性结合,说明利用核酸免疫蛋白加强法制备了高滴度、特异性强的兔抗棉铃虫CYP6B6的多克隆抗体。     

不同免疫方案制备家蚕抗菌肽多抗血清的比较

目的:以His-CecropinXJ融合蛋白、pcDNA3.0-cecropinXJ重组质粒为免疫原,分别采用蛋白皮下免疫、DNA肌肉免疫及使用活体基因导入仪肌肉免疫BALB/c小鼠,制备新疆家蚕抗菌肽的多克隆抗血清,并评价不同免疫方案对抗原免疫原性的影响。方法:采用间接ELISA测定免疫血清中抗新疆家蚕抗菌肽IgG抗体的滴度及亚型分类。用Western blot检测各免疫方案制备的抗血清,与新疆家蚕抗菌肽CecropinXJ抗原结合的特异性。结果:不同免疫方案均可诱导产生针对新疆家蚕抗菌肽不同滴度的多克隆抗血清。使用活体基因导入仪免疫后,可诱导高滴度的抗体产生。结论:以His-CecropinXJ蛋白免疫BALB/c小鼠后,可诱导高滴度的IgG1抗体产生;以pcDNA3.0-cecropinXJ质粒免疫后,可诱导针对IgG2a的抗体产生。     

产肠毒素大肠埃希菌CfaB亚单位的免疫原性分析

目的表达并纯化产肠毒素大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）CFA／I定居因子的CfaB亚单位,分析其免疫原性。方法将不含信号肽序列的cfaB基因克隆到pQE一30上,构建重组质粒pQE-30-cfaB并转化EcoliM15,表达融合蛋白6xHis—CfaB,将表达的蛋白纯化和复性后免疫BALB／c小鼠,制备抗CfaB的抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果6×His—CfaB融合蛋白高效表达,相对分子质量为15．5kD,纯化复性后免疫小鼠所得抗血清效价为1：125000。结论成功构建了高效表达6×His-CfaB融合蛋白的重组质粒,表达的融合蛋白免疫小鼠后获得了高效价的抗血清,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

小胸鳖甲胞外铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的主要抗氧化酶家族。基于原核表达系统,成功表达了拟步甲科Tenebrionidae小胸鳖甲Micordera punctipennis胞外铜锌SOD的重组蛋白(本文定义为Trx-His-MpecCu/Zn-SOD)。经Ni 2+亲和层析法纯化重组蛋白后,研究了重组蛋白的部分酶学性质。通过足垫加皮下注射法3次免疫小鼠后,分别用ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白浓度为1.33 mg·mL^-1,酶活力为27.52 U·mg^-1。Trx-His-MpecCu/Zn-SOD在25~45℃具有比较稳定的酶活性,在35℃最高,同时表现出比较广泛的酸碱耐受性(pH3~12),最适pH为9.0,表明重组蛋白的酶活性相对比较稳定。蛋白免疫法制备的鼠抗MpecCu/Zn-SOD多克隆抗体滴度高于1∶819 200。Western blot结果显示,该抗体能免疫结合重组蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD和小胸鳖甲体内天然MpecCu/Zn-SOD,但不能与黄粉虫Tenebrio molitor的总蛋白结合,说明制备的抗体效价较高且特异性较好。本研究结果为小胸鳖甲ecCu/Zn-SOD功能的深入研究奠定了基础。     

重组丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

本文旨在获得纯化丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(HCV-C)及抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C与肝细胞相互作用的分子机制奠定基础。首先以HCV1b亚型HC-J4-91全基因组质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HCV-C基因,构建重组质粒pQE31-HCV-C。融合蛋白经原核表达、纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备抗HCV-C多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果显示,表达HCV-C的原核表达质粒pQE31-HCV-C构建正确,获得相对分子质量约22000的纯化融合蛋白。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠的抗血清效价达1:12800。结果显示,自制的抗HCV-C多克隆抗体能特异性识别HCV-C。本研究获得了纯度较好、原核表达的HCV-C,并成功制备了抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C的致病机制提供了有实用价值的研究工具。     

利用基因免疫进行日本血吸虫Sj22蛋白抗体制备的研究

应用基因免疫方法制备日本血吸虫Sj22蛋白的抗体,并研究CpG佐剂和蛋白加强策略在增强基因免疫效果中的作用。采用肌肉注射的方法免疫小鼠,实验动物分为四组：A组注射pVAX1-sj22质粒100μg /只;B组注射pVAX1-sj22质粒50μg /只,同时注射CpG佐剂20μg /只;C、D组注射pcDNA3.1-sj22质粒100μg /只。分别在0,3,6周进行免疫,第9周A、B、C组用30μg重组sj22蛋白加强免疫,D组则用pcDNA3.1-sj22质粒100μg加强免疫。第0,9,10周割尾采血,使用ELISA方法进行抗体效价测定,Western blot验证抗体的特异性。结果表明：使用基因免疫的方法获得了针对Sj22的特异性抗血清,CpG佐剂能够有效降低质粒用量,基因免疫-蛋白加强的策略使得抗体的滴度提高了40～1280倍。     

小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

目的克隆小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因特异片段,制备小鼠Klotho多克隆抗体。方法以小鼠基因组为模板进行PCR,克隆了小鼠膜型抗衰老蛋白Klotho基因外显子Ⅳ部分序列,经BamH I和Nhe I双酶切后定向克隆到质粒pET-GST中,构建原核表达质粒pET-GST-Klotho,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达。以重组GST-Klotho融合蛋白免疫家兔,制备Klotho多克隆抗体。结果表达产物经SDS-PAGE检测表明,在大肠埃希菌中成功表达了GST-Klotho融合蛋白,GST-Klotho融合蛋白表达量占菌体总蛋白的15％左右;另外通过ELISA法测得抗血清抗体效价约为1：10000,Western印迹分析验证了抗体特异性。结论GST-Klotho融合蛋白的表达和Klotho多克隆抗体的制备为进一步研究Klotho蛋白在小鼠体内的表达模式以及相关抗衰老药物的研制奠定了基础。     

人巨细胞病毒磷蛋白65及糖蛋白B在大肠杆菌中的高效表达、免疫原性研究及初步应用

实验成功的构建了含有pp65与gB主要抗原决定簇基因的表达质粒pET-pp65、pET-gB;表达产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、间接酶联免疫等一系列鉴定试验进行了分析。表达蛋白经初步纯化后免疫BALB/c小鼠,经0、2、4周免疫三次,免疫后2、4、6周眼眶采血收集抗血清,进行中和试验和ELISA检测。动物试验表明两种表达蛋白具有免疫原性,并可在小鼠体内诱导产生特异性抗体,其中用重组gB蛋白免疫小鼠后得到的抗血清在体外试验中能抑制天然病毒感染细胞。同时将这两种表达蛋白作为诊断用抗原,对临床94份血清进行检测,证实pp65具有较好的特异性,为今后研制HCMV诊断试剂提供了科学依据。     

荒漠甲虫小胸鳖甲低温响应几丁质酶基因Mpcht19的克隆及表达模式分析

【目的】探索荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis低温响应的分子机理并挖掘其耐寒基因。【方法】根据低温转录组数据筛选并克隆小胸鳖甲几丁质酶基因,并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学法分析该基因在成虫不同组织中和4℃低温胁迫下的表达模式分析。【结果】从小胸鳖甲成虫克隆获得一个几丁质酶基因Mpcht19(Gen Bank登录号:KY126382)。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白Mp CHT19属于Ⅳ型昆虫几丁质酶,理论分子量约为27.18 k D,无信号肽,具亲水性。系统进化分析表明,Mp CHT19与赤拟谷盗Tribolium castaneumⅣ型几丁质酶Tc CHT19同源性最高,氨基酸序列一致性为34.05%。实时荧光定量PCR结果显示,Mpcht19在成虫脂肪体和后肠中高表达,具有组织特异性;该基因的表达还受4℃低温诱导。免疫组织化学分析结果显示,在4℃低温下Mp CHT19蛋白在脂肪体和后肠中表达。【结论】Mpcht19基因的表达具有组织特异性,并受低温诱导。研究结果有助于深入研究几丁质酶与小胸鳖甲耐寒性的关系。