荒漠昆虫小胸鳖甲Ras GTP酶激活蛋白基因 MpRasGAP 的克隆及低温表达分析

【目的】丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase, MAPK)级联是细胞的重要信息传递系统之一,Ras GTP酶激活蛋白（Ras GTPase-activating protein, RasGAP）基因 RasGAP 和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）基因 JNK 分别是MAPK信号转导途径的上、下游基因。本研究旨在确定荒漠昆虫小胸鳖甲 Microdera punctipennis RasGAP 及 JNK 基因对低温的响应情况。【方法】从荒漠甲虫小胸鳖甲中克隆获得 RasGAP 基因的cDNA序列,利用生物信息学分析软件分析其氨基酸序列并构建进化树,利用实时荧光定量PCR检测低温胁迫条件下 RasGAP 和 JNK 基因的表达情况。【结果】小胸鳖甲RasGAP cDNA的开放阅读框2 523 bp,命名为 MpRasGAP （GenBank登录号：KM677930）,编码840个氨基酸,分子量96.594 kDa,编码蛋白MpRasGAP属于RasGAP超家族。MpRasGAP与赤拟谷盗 Tribolium castaneum RasGAP的氨基酸序列一致性达89%。小胸鳖甲在4℃和-4℃低温胁迫1 h后,MpRasGAP 的mRNA水平都显著高于室温对照（25℃）。小胸鳖甲在4℃处理3 h或-4℃处理1 h后, MpJNK 的mRNA水平也显著升高。【结论】本研究结果表明小胸鳖甲MpRasGAP 和 MpJNK 的mRNA水平受低温诱导。研究结果有助于深入研究荒漠昆虫在低温下MAPK信号转导途径的作用机制。     

荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶抗血清的制备及抗体效价检测

目的几丁质酶是昆虫重要的防御物质,本研究采用DNA-蛋白质联合免疫策略制备荒漠昆虫小胸鳖甲几丁质酶(MpCHI786)的抗血清,用于检测小胸鳖甲在外界不良条件下几丁质酶的变化。方法从小胸鳖甲成虫中提取总RNA,反转录后RT-PCR扩增Mpchi786 cDNA,构建原核表达载体pET30a-Mpchi786,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达获得融合蛋白His-MpCHI786。对融合蛋白切胶纯化后与弗氏佐剂混合作为抗原。另外,构建真核表达质粒pcDNA3.0-Mpchi786,对小鼠尾静脉高压注射,8 h后RT-PCR检测其在肝脏的瞬时表达。以pcDNA3.0-Mpchi786肌肉注射免疫小鼠3次后,再用His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次,DNA免疫和免疫结束后收集免疫小鼠的血清,ELISA和Western blot法检测抗血清效价和特异性。结果 RT-PCR结果显示尾静脉高压注射8 h后,pcDNA3.0-Mpchi786质粒在小鼠肝脏有特异性表达。Western blot检测表明,用His-MpCHI786融合蛋白作为抗原,pcDNA3.0-Mpchi786DNA质粒免疫3次的抗血清和His-MpCHI786融合蛋白加强免疫2次后的抗血清都显示了特异性反应条带。ELISA检测结果显示抗血清效价高达1∶204 800以上。结论利用DNA-蛋白质联合免疫法能够获得效价高、特异性的小胸鳖甲几丁质酶MpCHI786的抗血清。     

荒漠甲虫小胸鳖甲胞外信号调节激酶ERK基因的克隆与低温表达谱分析

昆虫属变温生物,冷胁迫是其最常见的环境刺激。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路与细胞应对外界刺激密切相关,为了解MAPK信号通路在荒漠甲虫小胸鳖甲耐寒机制中的作用,从小胸鳖甲4℃转录组数据中筛选出胞外信号调节激酶(ERK)基因的全长c DNA,命名为Mp ERK。生物信息学分析表明,Mp ERK全长1125 bp,编码374个氨基酸。Mp ERK的理论分子量是43 k Da,含有ERK激酶所共有的磷酸化位点,属于MAPK超家族,与其它物种ERK的一致性达80%以上。实时定量PCR检测Mp ERK基因在低温下的表达谱发现,4℃处理1 h后,Mp ERK基因的表达上调为对照的7.5倍,5 h时达到高峰,为对照的15倍。-4℃处理1 h后,Mp ERK基因的表达上调为对照的8.4倍,5 h时达到高峰,为对照的13.75倍。研究结果表明Mp ERK基因是冷响应的,可能在小胸鳖甲应对低温时发挥信号转导作用。     

云南哀牢山和玉龙雪山森林树种幼苗对海拔梯度的响应及其季节性差异

林下树种幼苗是森林生态系统的一个重要组成部分,在森林的自然更新过程中发挥着重要作用.为了解树种幼苗的海拔分布格局以及森林群落林下幼苗对季节性气候的响应,本研究调查了云南省哀牢山(亚热带)和玉龙雪山(亚高山)两个地区的林下树种幼苗物种组成及个体数量的海拔分布格局及其季节动态.结果表明:随着海拔的升高,两个山体的树种幼苗物种丰富度均先增加后下降,优势种也呈现明显的变化;雨季末期的幼苗物种丰富度明显大于旱季末期,其中,占据优势地位的物种具有较明显的季节性差异;不同海拔带树种幼苗优势种也具有显著差异.     

大口黑鲈β-防御素在杆状病毒系统中的表达及抑菌活性

β-防御素是鱼类天然免疫的重要组成部分, 通过杆状表达系统表达大口黑鲈β-防御素, 研究其具有高效、广谱的不同于抗生素的独特抗菌的能力。研究通过序列分析, 发现大口黑鲈β-防御素(MSBdefe)与其他物种β-防御素具有相似的特征, 都包含6个保守的半胱氨酸。将MSBdefe基因进行昆虫密码子优化合成后, 克隆至穿梭载体pYBDM-IM质粒中, 构建成为重组质粒MSBdefe-pYBDM-IM, 重组质粒转化感受态细胞MultiBac/rSW106/asd-/inv+, 阳性重组菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am直接用于Sf9细胞的感染, 获得重组杆状病毒AV-MSBdefe。通过SDS-PAGE和Western Blot检测AV-MSBdefe感染Sf9细胞后蛋白表达, 结果表明成功获得MSBdefe重组蛋白。通过对淡水鱼类最常见的病原菌嗜水气单胞菌的抑菌活性分析, 结果显示当MSBdefe重组蛋白的终浓度为30 μg/mL时, 抑菌效率为83.00%, 并随着蛋白稀释2倍、4倍后, 即终浓度为15和7.5 μg/mL时, 抑菌效果逐渐减弱, 抑菌效率分别为54.33%和33.67%, 进而验证了大口黑鲈β-防御素能够抑制嗜水气单胞菌的生长, 且随着蛋白浓度的降低抑制能力下降。这些结果为利用昆虫生物反应器规模化生产鱼类β-防御素奠定了基础, 以期为开发能够替代或部分替代抗生素的天然抗菌剂提供良好的候选者和技术途径。     

粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶（ACC）基因的克隆及CT功能域基因的原核表达

利用简并PCR结合染色体步移法首次克隆获得粘红酵母乙酰辅酶A羧化酶（ACC）基因的全长序列信息。序列分析表明,该基因包含2个内含子,分别位于42～147 bp和315～677 bp处,编码区域总长为6 801bp,推导的氨基酸序列进行二级结构分析具备乙酰辅酶A羧化酶典型的3个功能域：生物素羧化酶（BC）、生物素羧基载体蛋白（BCCP）和羧基转移酶（CT）。克隆该基因的CT功能域基因,连接到原核表达载体pET-28a上,在Escherichia coli BL21（DE3）中成功表达,利用Ni-NTA树脂柱纯化获得CT的可溶性重组蛋白,浓度为1.8mg/mL,为研究ACC的功能和针对CT作用的除草剂机理研究提供了有价值的材料。     

三角褐指藻的诱变育种及产EPA的条件研究

旨在获得不饱和脂肪酯EPA产量更高的藻种,利用0.6% EMS对三角褐指藻进行诱变。通过单细胞分离技术得到1株突变株EP1,其EPA产量比出发藻株提高了19.81%。结果显示,突变藻株产EPA的最适条件为:NaNO3 75 mg/L,pH7.5,昼夜温度17-15℃,接种量为12%。最适条件下培养7 d,其EPA产量可达26.77 mg/g。传代试验表明,突变藻株具有较好的遗传稳定性。     

荒漠昆虫小胸鳖甲抗菌肽Attacin基因的克隆及低温表达模式分析

昆虫在低温冷驯化过程中会发生很多基因表达的改变, 从转录组层面上开展广泛的研究有助于全面认识昆虫对冷响应的分子机制。为了对荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的 4℃低温转录组数据中一个上调表达的Attacin基因（MpAttacin1）进行深入了解并分析其对低温诱导的响应情况, 本研究通过生物信息学分析对该基因进行了鉴定, 并利用实时荧光定量PCR对其在低温下的mRNA水平进行了检测。结果表明： 获得的MpAttacin1 cDNA长度为523 bp, 包含一个456 bp的开放阅读框和67 bp的5′端非翻译区。MpAttacin1编码含有151个氨基酸残基的多肽, N端含有17个氨基酸的信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与其他鳞翅目、 双翅目和鞘翅目昆虫的抗菌肽Attacin具有30%~40%的一致性。以邻接法（neighbor-joining, NJ）构建的系统进化树表明, 小胸鳖甲Attacin1与其他鞘翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attacin_C超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示, 在4℃与-4℃低温胁迫时, MpAttacin1基因的转录都呈现先升高后降低的应激反应趋势, 但在对低温的响应时间和强度上有所不同。在4℃处理5 h和9 h后, MpAttacin1的表达量分别为对照组的2.3和3.8倍, 而在-4℃处理7 h和9 h后, 分别为对照组的2.4和1.5倍。这些研究表明, 除已知的抗菌功能外, Attacin在昆虫的低温适应过程中可能也发挥着重要的作用。