尼古丁受体CHRNA5 亚基突变对其功能影响的初步研究

摘要 目的：研究CHRNA5亚基突变对尼古丁受体功能的影响。方法：通过RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,并通过重叠延伸PCR方法对CHRNA5亚基基因定点突变,从而构建CHRNA5突变型及野生型表达载体,然后转染至HEK293T细胞中,检测其基因表达。并将其分别与CHRNA3和CHRNB4共转至HEK293T细胞中,检测三质粒共转后的基因表达;通过采用尼古丁持续灌流细胞10 min,然后检测细胞内钙离子内流峰值的变化情况,接下来检测突变对转染后细胞活力的影响。结果：构建的CHRNA5表达载体在转染HEK293T细胞48 h后,能够检测到绿色荧光蛋白的表达,这证明重组载体已成功转染进HEK293T细胞;通过RT-PCR检测出转染细胞CHRNA5 mRNA表达,这证明CHRNA5突变型和野生型均在HEK293T细胞中成功进行了表达。通过尼古丁灌流细胞实验显示突变组和野生型组F340/F380峰值变化均值分别为0.865±0.048和0.447±0.127,突变体组峰值显著高于野生型组（P<0.05）。细胞活力检测实验发现0.01 mM和0.1 mM尼古丁刺激下突变组的细胞活力峰值分别为139%和137%,显著高于野生组的124%和126%,有显著差异（P<0.05）。结论：本研究成功构建了CHRNA5突变及野生型真核表达载体,发现CHRNA5的突变会导致其受体功能性改变,并影响细胞活力。     

293T细胞中SQSTM1/p62-GFP的表达及其与LC3在诱导自噬状态下的定位分布

为探究SQSTM1/p62蛋白在细胞发生自噬时的定位,以人肺腺癌A549细胞的cDNA为模板,PCR扩增SQSTM1基因(编码p62蛋白)并将其插入pEGFP-N1真核表达质粒.将重组质粒转染进入人胚肾293T细胞中表达p62绿色荧光融合蛋白(GFP-p62),利用Earle's盐平衡溶液饥饿诱导细胞自噬,Western blotting和激光共聚焦显微镜检测GFP-p62的表达及其与自噬相关蛋白LC3在自噬细胞中的定位.结果发现,重组载体pEGFP-N1-p62转染293T细胞后,293T细胞能高效表达GFP-p62融合蛋白,内源性p62所占细胞内总p62比例很低.饥饿诱导后细胞自噬体形成,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例明显增高,p62蛋白表达下调.同时还发现,GFP-p62在自噬细胞中仅定位于大多数自噬体且与LC3共定位,小部分自噬体及自噬体以外区域没有明显GFP-p62分布.本研究建立了一种通过p62-GFP与LC3的共定位检测人胚肾293T细胞自噬时p62蛋白和LC3聚集体的有效方法,.提示了使用内源性p62低表达细胞作为研究p62和细胞自噬的优势,也将有助于开展关于p62在细胞中定位与其生物学功能关系的研究工作.     

HCMV感染对胶质瘤细胞U87自噬的影响

研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对神经胶质瘤U87细胞自噬的影响。通过观察微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关基因Beclin1及其蛋白表达的变化,从而探讨HCMV与神经胶质瘤发生、发展的关系及意义。用HCMV AD169(MOI=5)感染神经胶质瘤U87细胞,同时将未感染HCMV的U87细胞作为对照组。分别在6、12、24、48 h用RT-PCR检测Beclin1的表达,Western-blot和免疫荧光检测Beclin1和LC3编码蛋白的表达,最后用CCK-8检测细胞的增殖活性。结果显示,HCMV感染的U87细胞LC3-II蛋白表达水平逐渐下降(P<0.05);同时,HCMV感染的U87细胞Beclin1基因及蛋白的表达水平也逐渐下降(P<0.01),且HCMV感染U87细胞增殖显著(P<0.01)。以上结果表明,HCMV感染抑制胶质瘤U87细胞自噬,并会引起Beclin1表达水平下调,进而导致胶质瘤细胞增殖。     

携带Flag标签的人自噬相关蛋白4B的真核表达及功能鉴定

目的:构建携带Flag标签的人自噬相关基因4B(ATG4B)的真核表达质粒,获得Flag-ATG4B融合蛋白,并检测其与LC3的相互作用。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增获得ATG4B序列,并将其插入pc DNA3.0-Flag载体构建成重组质粒,转染HEK293T细胞后用Western印迹检测融合蛋白的表达,用免疫共沉淀检测ATG4B与LC3的相互作用。结果:菌液PCR和重组质粒的双酶切结果及测序均表明重组质粒构建成功,Western印迹表明融合蛋白在HEK293T细胞中获得表达,免疫共沉淀结果表明表达的ATG4B能与LC3结合。结论:构建了pc DNA3.0-Flag-ATG4B真核表达质粒,表达的ATG4B蛋白对LC3的切割至关重要,这为进一步研究ATG4B在自噬过程中的作用奠定了基础     

转化生长因子β1影响三阴性乳腺癌顺铂耐药的机制研究

摘要 目的：建立三阴性乳腺癌MDA-MB-231/顺铂（DDP）耐药细胞株,探讨转化生长因子β1（TGF-β1）调控三阴性乳腺癌DDP耐药的机制。方法：采用小剂量间歇诱导法建立MDA-MB-231耐药细胞株（MDA-MB-231/DDP）,在MDA-MB-231/DDP中构建TGF-β1沉默细胞并分为TGF-β1沉默组（sh-TGF-β1）、阴性对照组以及对照组,实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测TGF-β1含量。另取MDA-MB-231细胞和MDA-MB-231/DDP细胞分为MDA-MB-231组（正常培养MDA-MB-231敏感细胞）、MDA-MB-231-DDP组（正常培养MDA-MB-231 DDP耐药细胞）、TGFβ1-shRNA组（MDA-MB-231 DDP细胞转染TGFβ1-shRNA慢病毒载体）和MDA-MB-231-DDP+3-MA组（MDA-MB-231 DDP细胞给予5mM 3-MA处理2 h）。细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测耐药株的半数抑制浓度（IC₅₀）,并计算耐药指数及逆转耐药指数,RT-qPCR检测TGF-β1含量,蛋白印迹法（Western blot）检测TGF-β1、自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II表达量,激光共聚焦显微镜观察自噬流的变化,应用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果：成功建立DDP耐药细胞株MDA-MB-231/DDP,耐药指数为5.231;MDA-MB-231/DDP细胞的TGF-β1 mRNA表达和蛋白表达较MDA-MB-231细胞显著上调（P<0.05）。DDP耐药细胞MDA-MB-231/DDP中自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达较MDA-MB-231细胞显著升高（P<0.05);应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）后MDA-MB-231/DDP细胞自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达显著下降（P<0.05);沉默MDA-MB-231/DDP细胞的TGF-β1基因后,DDP耐药细胞株的耐药指数从5.231下降到3.404,同时自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I表达降低（P<0.05）,且激光共聚焦显微镜观察到黄色和红色斑点的显著减少,表明自噬受到抑制。结论：TGF-β1与三阴性乳腺癌DDP耐药有关,其机制可能是增加自噬引起MDA-MB-231细胞DDP耐药。通过沉默TGF-β1可降低自噬水平,恢复三阴性乳腺癌细胞对DDP的敏感性。     

CHOP双重调控衣霉素诱导的DU-145细胞凋亡及自噬的研究

目的研究内质网应激分子CHOP调控细胞凋亡与自噬的作用和机制。 方法利用衣霉素诱导DU-145细胞产生内质网应激,Western Blot法检测内质网应激相关分子Grp78、Grp94、p-eIF2α和CHOP及自噬蛋白LC3Ⅱ、Atg5和Beclin1的表达;用流式细胞术检测细胞凋亡水平;沉默CHOP基因,用Western Blot法检测凋亡蛋白PARP、Caspase3的表达,流式细胞术检测细胞凋亡;并利用免疫荧光检测自噬标志性蛋白LC3B的表达。 结果衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激能诱导一定程度的细胞凋亡,衣霉素处理8、12、24?h的细胞凋亡率分别为3.27﹪±1.02﹪,8.97﹪±0.71﹪和11.67﹪±1.41﹪,处理12?h及24?h的细胞凋亡率与对照组相比差异具有统计学意义（P < 0.01）。同时也能通过抑制PI3K/AKt/mTOR信号通路激活DU-145细胞自噬。CHOP基因沉默抑制细胞凋亡,shCtrl组细胞凋亡率为32.17﹪±3.93﹪,shCHOP-1组细胞凋亡率为23.53﹪±3.41﹪,两组相比差异具有统计学意义（P < 0.05）。且CHOP基因沉默能促进细胞自噬分子LC3B的表达。 结论衣霉素诱导DU-145细胞内质网应激状态下,CHOP在细胞凋亡与自噬之间发挥双重调控作用。     

miRNA-383对急性胰腺炎腺泡细胞自噬的影响作用

目的:检测转染mi RNA-383的急性胰腺炎细胞模型中自噬标志蛋白LC3及Beclin1的表达情况,研究mi RNA-383对急性胰腺炎腺泡细胞自噬功能的影响作用。方法:在前期工作中利用生物信息技术筛选出在急性胰腺炎中表达下调的mi RNA-383。培养AR42J细胞,转染mi RNA-383类似物、抑制物以及阴性对照。使用牛磺胆酸钠盐以浓度200μM刺激细胞20 min制造急性胰腺炎细胞模型,使用BZi PAR检测胰酶激活程度证明此造模方法成功后,以此条件在转染完成后刺激AR42J细胞制造急性胰腺炎细胞模型。牛磺胆酸钠盐以浓度200μM刺激细胞20 min后提取细胞蛋白,利用western blot技术检测各组自噬标志蛋白Beclin1的表达情况及LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值的变化。结果:急性胰腺炎细胞模型造模成功,western blot技术检测mi RNA-383抑制物转染组AR42J细胞自噬标志蛋白Beclin1表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值上调(P0.05),mi RNA-383类似物转染组细胞Beclin1表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的值下调(P0.05)。结论:mi RNA-383可以降低急性胰腺炎时细胞自噬水平,下调mi RNA-383的表达可以提高急性胰腺炎时细胞自噬水平。     

嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP)对RAW264.7细胞自噬的影响

【目的】观察嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(immunogenic protein,IP)对RAW264.7细胞自噬流及自噬相关因子表达水平的影响并探讨其作用机制。【方法】采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化嗜肺军团菌重组免疫原蛋白(IP),并用CCK-8法检测IP对RAW264.7细胞半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC₅₀)。采用低浓度(0.05×IC₅₀)、中浓度(0.1×IC₅₀)、高浓度(0.2×IC₅₀) IP与RAW264.7细胞进行体外共培养1、3、6、12 h,并设细胞对照组,应用自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测巨噬细胞自噬流的变化,筛选最佳浓度进行后续实验;最佳浓度IP与RAW264.7细胞进行体外共培养6、12、24 h,并设细胞对照组,RT-qPCR检测各组自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、SQSTM 1 (sequestosome 1,p62)及组蛋白去乙酰化酶6 (histone deacetylase 6,HDAC6)的mRNA表达水平;Western blotting法检测各组自噬相关因子的蛋白表达水平;免疫荧光检测各组自噬相关因子的表达。【结果】根据CCK-8结果计算IC₅₀为0.26μg/μL。自噬双标质粒pmCherry-C1-EGFP-LC3B检测自噬流结果显示,与对照组相比,中浓度(0.026μg/μL) IP与RAW264.7细胞进行体外共培养后自噬流抑制显著。RT-qPCR及Western blotting检测结果显示,与对照组相比,IP与RAW264.7细胞共培养6 h,P62表达水平升高,LC3B、HDAC6、Beclin1表达水平均降低,P<0.05;与6 h组相比,12 h组LC3B表达水平降低,P62、HDAC6及Beclin1表达水平均升高,P<0.05;与12 h组相比,24 h组Beclin1表达水平升高,P<0.05。IP一定程度上以时间依赖的方式降低了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值并升高了P62蛋白的表达水平,P<0.05。免疫荧光结果基本与RT-qPCR及Western blotting检测结果一致。【结论】嗜肺军团菌IP抑制巨噬细胞自噬,可能与通过影响自噬小体-溶酶体融合途径,干扰自噬小体及自噬溶酶体的形成、成熟等过程有关。     

黄芩苷诱导自噬改善胰岛素抵抗

探讨黄芩苷对胰岛素抵抗的作用及其机制,将大鼠肝脏间质细胞(BRL-3A细胞)分成空白组、模型组、黄芩苷高剂量组和黄芩苷低剂量组。除空白组以外,其余组BRL-3A细胞均采用0.2 mmol/L棕榈酸(PA)处理,并给予相应药物进行干预,检测葡萄糖消耗量和甘油三酯含量;Western blotting法检测自噬蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Becline1的表达,RT-qPCR法检测自噬基因Beclin1的表达。结果显示:经PA处理之后,BRL-3A细胞对葡萄糖的消耗量减少,甘油三酯水平增加,表明BRL-3A细胞出现葡萄糖的摄取和利用障碍,以及脂代谢紊乱,证明胰岛素抵抗细胞模型复制成功。而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Beclin1 mRNA的表达均明显减少,表明细胞自噬被抑制。黄芩苷高、低剂量组均能增加BRL-3A细胞对葡萄糖的消耗量,减少甘油三酯水平;LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1和Beclin1 mRNA的表达也明显增加,且黄芩苷高剂量比低剂量效果明显。本研究表明:黄芩苷可以增加BRL-3A细胞对葡萄糖的摄取利用,减轻脂质代谢紊乱,从而改善胰岛素抵抗,具体作用机制可能与其诱导细胞自噬有关。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路在脂多糖诱导的大鼠肝星状细胞自噬中的作用

该文探讨了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在脂多糖(LPS)诱导的大鼠肝星状细胞-T6(HSC-T6)自噬中的作用。体外培养HSCT6细胞,随机分为对照组、LPS组、雷帕霉素(Rapamycin, Rapa)组、LPS+Rapa组、LY294002组、LPS+LY294002组, SC79组、LPS+SC79组,各组经相应处理后,单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察自噬溶酶体变化;细胞免疫荧光法检测各组微管相关蛋白轻链Ⅱ(LC3 Ⅱ)表达; Western blot检测各组通路蛋白p-Akt、p-mTOR、Akt、mTOR及自噬相关蛋白LC3 Ⅱ、Beclin1的表达; qRT-PCR检测各组LC3 Ⅱ和Beclin1 mRNA的表达。结果显示,LPS+Rapa组、LPS+LY294002组较LPS组的自噬溶酶体、LC3 Ⅱ荧光亮点含量无明显差异(P0.05), LPS+SC79组较LPS组的自噬溶酶体、LC3 Ⅱ荧光亮点含量明显减少(P0.05); Western blot显示, LPS+Rapa组、LPS+LY294002组较LPS组LC3 Ⅱ、Beclin1、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平无明显差异(P0.05), LPS+SC79组较LPS组LC3 Ⅱ、Beclin1含量明显减少, p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显增加(P0.05); qRT-PCR显示LPS+Rapa组、LPS+LY294002组较LPS组LC3 Ⅱ、Beclin1 mRNA含量无明显差异(P0.05), LPS+SC79组较LPS组LC3 Ⅱ、Beclin1 mRNA含量明显减少(P0.05)。该项研究结果表明,LPS可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进HSC-T6细胞自噬。     

HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定

目的构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体。方法采用DNA重组技术,将目的基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack—CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5a;筛选出重组质粒pAdTrack—CMV—HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pad—HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad—HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT—PCR、Western印迹鉴定外源基因HAX1的表达。BrdU检测感染了Ad—HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况。结果pAdTrack—CMV—HAX1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—HAX1质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符。构建好的Ad—HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达。HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高。结论成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖。     

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的:利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(APOBEC)3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果:PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论:实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒(PERV)的抑制作用奠定了基础。     

人尿激酶型纤溶酶原激活因子截短型突变体与绿色荧光蛋白在真核细胞HEK293F中的融合表达

目的:构建人尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)截短型突变体与绿色荧光蛋白(EGFP)分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达。方法:采用PCR法,分别以质粒pIRES2-EGFP和重组质粒pcDNA3.1(+)/uPA为模板,扩增出带BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的EGFP及带NheⅠ和HindⅢ酶切位点的uPA截短体基因片段,先后将EGFP和截短型uPA基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,转入HEK293F细胞,用G418对转染细胞进行加压筛选,通过共聚焦显微镜观察和ELISA方法鉴定表达产物。结果:DNA测序结果显示,uPA不同截短型突变体基因片段与EGFP基因融合的真核表达载体构建成功,共聚焦显微镜观察发现HEK293F细胞中有绿色荧光且定位于细胞质中,ELISA检测到HEK293F细胞培养上清中分泌型融合蛋白的表达。结论:构建了uPA截短型突变体与EGFP分泌型融合表达载体并在真核细胞中表达,为后期研究uPA的相互作用蛋白及其生理功能奠定了基础。     

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。     

自噬相关基因LC3-I的基因表达及单克隆抗体的制备

目的：通过克隆LC3．I基因,体外原核表达LC3-I蛋白后制备抗LC3单克隆抗体,作为自噬研究中的标记分子检测自噬的发生和发展过程。方法：RT．PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆LC3基因,亚克隆至pQE80L原核表达载体后转化E．cobDH5a进行诱导表达,SDS—PAGE电泳及Westemblot鉴定表达蛋白。蛋白纯化后免疫BALB／c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术,制备分泌抗LC3．I杂交瘤细胞株,体内诱生腹水制备mAb,间接ELISA法测定其效价,辛酸一硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。结果：成功克隆了LC3一I基因,并对其在E．coilDH5a进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子量Mr为20×10^3有特异条带,Westernblot验证表达产物具有一定的生物学活性。建立了3株稳定分泌特异性抗LC3-ImAb的杂交瘤细胞株,诱导产生的腹水获得的抗体效价在10^5-10^7之间,结论：在E．coli中对LC3-I进行表达,并制备特异性较强抗LC3-I蛋白的单克隆抗体。为自噬研究提供了良好的标记分子,可对自噬形成和发展进行有效的检测。     

斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技...     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

人激活转录因子5基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的人激活转录因子5（ATF5）的真核表达载体,获得myc-ATF5融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的带有XL5标签的ATF5质粒为模板,采用PCR技术扩增ATF5编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体中,Western印迹检测其表达;将重组质粒与空载体分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和qRT-PCR检测其下游基因哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在蛋白和mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-ATF5真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;Western印迹和qRT-PCR证明myc-ATF5可升高roTOR的转录和蛋白水平。结论：构建了带myc标签的人ATF5真核表达载体,为进一步研究ATF5在自噬中的功能奠定了基础。     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。