两株副溶血弧菌烈性噬菌体的分离鉴定

研究旨在筛选烈性噬菌体, 为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)病害防控增加新的选择。以副溶血弧菌Vp13为宿主菌, 通过二层琼脂平板法筛选, 分离到了2株烈性噬菌体SX-2和SX-F。对其形态结构进行了透射电镜观察, 利用DNase I、 RNase A、Mung Bean Nuclease和Hind Ш酶进行噬菌体核酸类型鉴定, 并对噬菌体的裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线进行了测定。透射电镜观察结果显示: SX-2核衣壳头部长约110 nm, 宽约50 nm, 尾部长约150 nm, 宽约10 nm, 为典型的复合体制; SX-F核衣壳呈正六边形, 长约为56.86 nm,宽约50.74 nm, 未观察到尾部, 推测为正二十面体对称; 核酸测定结果显示两者均为线性双链DNA。依据国际病毒分类委员会第九次报告, SX-2符合肌尾噬菌体科特征, SX-F符合盖噬菌体科特征。噬菌体SX-2和SX-F对85株弧菌裂解结果显示: 噬菌体SX-2能够裂解23株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 噬菌体SX-F能够裂解19株副溶血弧菌和1株溶藻弧菌。SX-2和SX-F的最佳感染复数均为0.0001。一步生长曲线结果显示: SX-F的潜伏期约10min, 裂解期约70min, 裂解量为116.2; 噬菌体SX-2的潜伏期小于10min, 裂解期大约70min, 裂解量为209.3。两株噬菌体生物学特性表明SX-2与SX-F均为烈性噬菌体, 这为进一步探讨噬菌体防治技术奠定了基础。     

斑马鱼myd88和traf6真核表达载体的构建

髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88,MYD88)和 TNF 受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)均属于 Toll 样受体(Toll-like receptors,TLR)家族成员中的关键衔接分子.斑马鱼是研究先天免疫应答的独特模式生物,为了构建myD88和traf6的真核表达载体,用于免疫应答机制的研究,克隆了斑马鱼myd88和traf6基因的编码区CDS全长序列,分别是855 bp和1 629 bp.结构分析表明,斑马鱼MYD88存在2个保守结构域为死亡结构域和TIR结构域,TRAF6存在4个保守结构域分别为RING结构域、2个锌指结构域、环-环(coiled-coil)结构域以及TRAF同源结构域(meprinand TR-AF-homology,MATH),并与其他物种氨基酸序列一致性较高.系统进化树分析发现斑马鱼myd88和traf6基因与硬骨鱼类亲缘关系较近,说明斑马鱼myd88和traf6基因的同源性符合其在物种进化上的地位并且具有很高的结构同源性.将斑马鱼myd88和traf6基因的CDS全长序列连接至pCMV-Tag2B表达载体.通过对重组质粒进行双酶切检测发现,成功克隆了斑马鱼pCMV-myd88和pCMV-traf6真核表达载体.为了验证这2个真核表达载体的生物学功能,本研究在HEK293T细胞中进行NF-κB的报告基因活性检测.结果表明,过表达myd88和traf6基因后,斑马鱼NF-κB家族nfκbl启动子的转录活性显著升高,分别约为空载对照组的2.5倍和8倍.鉴于MYD88和TRAF6在天然免疫功能等方面的重要作用,实验结果为以后研究斑马鱼的先天免疫信号传导过程提供了有力的研究工具.     

金鱼ABC转运蛋白基因家族成员鉴定及分析

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC transporter)基因家族在原核生物和真核生物中广泛存在,该家族蛋白能够利用ATP裂解产生的能量将多种底物转运到膜上,参与多种生物过程,如营养摄入、细胞解毒、脂质稳态、信号转导、病毒防御以及抗原呈递等。目前,鱼类中,只在斑马鱼、斑点叉尾鮰和鲤鱼等少数鱼类中对该基因家族进行了系统的研究,关于金鱼ABC转运蛋白基因家族的详细分析,未见报道。本研究中,我们利用三代结合二代测序技术构建的金鱼转录组参考基因集数据,鉴定出55个ABC转运蛋白基因,通过系统进化分析将它们分为8个亚家族(A^H)。即金鱼ABC转运蛋白基因是由10个ABCA、14个ABCB、13个ABCC、5个ABCD、1个ABCE、4个ABCF、7个ABCG和1个ABCH组成。同时,我们将金鱼与斑马鱼、斑点叉尾鮰和鲤鱼等物种ABC转运蛋白基因家族成员的数目进行比较分析,推测硬骨鱼类特异的第3次全基因复制(3R-WGD)和谱系特异的第4次全基因组复制(4R-WGD)对金鱼该基因家族成员数目的影响。本研究结果为金鱼ABC转运蛋白基因功能的研究提供了理论依据。     

斑马鱼eomesb基因突变体的构建及其功能分析

Eomesodermin (Eomes)是T-box转录因子基因家族的成员,在脊椎动物胚胎发育、模式形成和形态发生过程中发挥重要作用.斑马鱼(Danio rerio) eomesa基因的一个点突变导致其母源合子突变体胚胎发育延迟而大量死亡,而eomesa合子突变体可正常发育至性成熟,但缺失背鳍.本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼eomesa旁系同源基因eomesb的突变体,eomesb纯合突变体不仅可正常发育至性成熟,而且鳍的发育也完全正常.q-PCR和整体原位杂交实验结果显示,eomesa和eomesb在脑部组织具有重叠的表达域,eomesb在中脑的表达略高于eomesa,故推测两基因在脑部可能行使相似的功能,存在一定的功能冗余.对2,4,6 dpf(Days post fertilization)和6 dpf的WT和突变体q-PCR基因表达分析显示,eomesb突变对eomesa的表达没有明显影响.eomesa-/-;eomesb-/-双突变体未出现背鳍缺失以外的附加表型,推测斑马鱼eomesa和eomesb在背鳍发育过程中可能不存在功能冗余,eomesb不参与背鳍的发育过程.此外,整体原位杂交实验结果显示,eomesb突变也不影响其同源基因tbr1a和tbr1b的早期表达.eomesb纯合突变体未观察到明显表型,可能与其影响的功能不引起明显表型有关,也可能与其它基因的遗传补偿效应有关.本研究结果为深入研究斑马鱼eomesb基因的功能提供了实验材料,同时对研究eomesa与eomesb基因功能分化具有参考价值.     

东北七鳃鳗TRAF6基因克隆、表达分析及亚细胞定位研究

为研究TRAF6在TLR信号介导的先天免疫中的调控作用, 研究通过克隆技术获得了东北七鳃鳗(Lethenteron morii)TRAF6基因的cDNA全长, 命名为LmTRAF6。利用实时荧光定量方法(qPCR)分析了LmTRAF6在幼鱼和成鱼中各组织的表达情况以及在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染后脂肪体、鳃、肠和肾组织在不同时间点的表达量变化。利用双酶切技术构建pEGFP-TRAF6重组质粒并转染HEK293T细胞, 48h后进行荧光观察并拍照。结果表明, LmTRAF6的cDNA全长为2751 bp, 开放阅读框(ORF)为1785 bp, 编码594个氨基酸。其蛋白结构域高度保守, 具有RING结构、两个锌指结构、环-环(Coiled-coil)α螺旋结构域和MATH结构域。通过系统进化树分析, 发现LmTRAF6与哺乳类以及鱼类TRAF6的亲缘关系较近, 与果蝇、中国对虾TRAF6的亲缘关系较远。qPCR结果显示, LmTRAF6在各组织中均有表达, 在幼鱼的心脏、皮肤、鳃、肝中的表达量相对较高, 而在肠中表达量相对较低。在成鱼的肾、鳃、肌肉中的表达量相对较高, 而在心脏中表达量相对较低。成鱼LmTRAF6在铜绿假单胞菌感染后, 鳃、肠和肾的表达量在24h达到峰值。细胞定位显示, LmTRAF6在HEK293T的细胞质和细胞核中均有表达。以上结果为进一步探究七鳃鳗中TRAF6在TLR信号通路中的作用奠定了理论基础。     

七鳃鳗KCTD基因家族成员全基因组鉴定及进化分析

钾离子通道四聚化结构域(KCTD)蛋白基因家族是一个保守的基因家族,该家族成员的共同特征是具有一个含有BTB保守结构域的N-末端和一个可变的C-末端。KCTD基因的突变或不正常调控与人类多种疾病相关。七鳃鳗是现存最原始的脊椎动物,作为联系无脊椎动物和脊椎动物之间的桥梁,在生物进化研究中占有重要地位。本研究通过对海七鳃鳗(Petromyzon marinus)和日本七鳃鳗(Lethenteron japonicum)基因组和转录组数据分析,全面系统地鉴定了海七鳃鳗和日本七鳃鳗KCTD基因家族成员,并对其基因结构特征、蛋白保守基序和基因表达模式进行了分析。在海七鳃鳗和日本七鳃鳗中分别鉴定出13个和14个KCTD基因,基因长度和外显子数目在不同KCTD基因间变化很大,KCTD蛋白中4个基序保守性显著,大多数KCTD基因呈泛表达模式,并且在胚胎发育时期明显高表达。除七鳃鳗外,对12个无脊椎动物和脊椎动物代表物种KCTD基因家族成员进行了鉴定,并对KCTD基因家族成员的进化关系进行了分析。根据进化树聚类情况,将KCTD基因家族成员分为11个亚家族。进化分析结果显示,KCTD基因家族从低等的无脊椎动物线虫和果蝇到高等的人类都存在;线虫中仅有5个成员,果蝇中有8个成员,随着物种进化程度由低到高,KCTD家族成员数目呈现增加的趋势;从爬行类开始,脊椎动物KCTD基因数目稳定在24个左右。硬骨鱼类特有的全基因组复制事件影响鱼类KCTD基因数目。本研究结果不仅丰富了七鳃鳗KCTD基因家族信息,同时也对KCTD家族基因间的进化关系进行了探究,为深入研究该家族基因功能提供了一定的依据。     

斑马鱼notch3基因真核表达载体的构建及其表达分析

为了进一步研究notch3基因在斑马鱼中的功能,构建了斑马鱼notch3真核表达载体并在真核细胞中成功表达.其中斑马鱼notch3基因编码序列(coding sequence,CDS)从NCBI的在线数据库中获得,根据序列克隆其胞内段(notch intracellular domain,NICD),接着利用同源重组技...