稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞单克隆株的建立

目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10~8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。     

猪内源性反转录病毒囊膜基因env真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建猪内源性反转录病毒(PERV)囊膜基因env的真核表达质粒pHCMV-env并加以鉴定,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定基础。方法:用RT-PCR方法扩增五指山猪来源PERV的env基因,将其插入pGEM-T easy载体中,构建重组质粒pGEM-T-env,酶切鉴定正确后,将pGEM-T-env与pHCMV-VSV-G表达质粒同时经EcoRⅠ酶切消化后连接,构建重组表达质粒pHCMV-env,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的质粒pHCMV-env转染HEK293T细胞,采用PCR、RT-PCR检测转染后env基因的整合和转录情况。结果:扩增得到五指山猪来源PERV的env基因,并构建了pHCMV-env真核表达质粒,转染HEK293T细胞系后,该细胞系中有目的基因的整合和转录。结论:构建了真核表达质粒pHCMV-env,并且在HEK293T细胞中能够整合并转录,为研究PERV的细胞嗜性和宿主范围奠定了基础。     

SOCS3基因重组腺病毒的构建及其在猪脂肪细胞中的表达

本研究旨在构建细胞因子信号转导抑制因子3(Suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)的重组腺病毒表达载体,获得有感染性的病毒颗粒。以pcDNA3-SOCS3质粒为模板扩增SOCS3基因,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,经测序验证后,重组的穿梭质粒用PmeI酶切线性化后转化到BJ5183感受态细菌中与其内的骨架载体pAdEasy-1进行同源重组,获得的重组质粒pAd-SOCS3,经PacI线性化后转染至HEK293细胞中进行包装和扩增,纯化后用TCID50法测定病毒滴度。以重组的病毒感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达,RT-PCR和Western blotting检测细胞内SOCS3 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒载体pAd-SOCS3经酶切及PCR鉴定正确,病毒滴度为1.2×109PFU/mL;感染原代培养的猪脂肪细胞后,荧光显微镜观察可见报告基因GFP的表达;RT-PCR和Western blotting检测到细胞中SOCS3 mRNA和蛋白的表达显著提高。本研究成功构建了SOCS3基因的重组腺病毒,感染原代培养的猪脂肪细胞可稳定表达SOCS3蛋白,为深入研究SOCS3的功能奠定了基础。     

表达萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型的建立

目的:构建基于萤光素酶的单次复制人免疫缺陷病毒(HIV)细胞模型,用于抗HIV药物的筛选。方法:构建含萤光素酶报告基因的假型慢病毒质粒,将疱疹性口炎病毒外膜糖蛋白(VSV-G)的表达质粒、HIV-1 Rev蛋白表达质粒、HIV Gag-Pol蛋白表达质粒和含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒共转染HEK 293FT细胞,制备假型慢病毒;在假型慢病毒生产和再感染新鲜HEK 293FT细胞的过程中加入逆转录酶和蛋白酶抑制剂(如AZT),检测再感染的细胞中萤光素酶的表达水平,从而判断药物对HIV的抑制作用。结果:构建了含萤光素酶报告基因的重组慢病毒质粒pLenti-Luc;利用已知抗HIV药物AZT进行测试,发现HIV药物处理组细胞中萤光素酶活性远低于对照组。结论:建立了基于萤光素酶的HIV药物筛选细胞模型,该系统使用单次复制的报告病毒,具有良好的安全性,而使用萤光素酶基因作为报告基因使该系统具备极高的敏感性,该系统适合于进行高通量药物筛选。     

共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因及猪γ-干扰素基因的腺病毒载体的构建与鉴定

利用PCR方法分别扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因（E蛋白）,EMCV的核糖体介入位点（IRES）序列及猪γ-干扰素（IFN-γ）基因全长序列,序列测定正确后用DNA重组法将三者串联后插入pAdenoVator-CM V5-IRES-GFP穿梭质粒中,形成的穿梭质粒plRES-GP5-IFN-γ用PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架载体pAdEasy-1共转化感受态大肠埃希氏菌BJ5183,经同源重组,构建成含有GP5基因和IFN-γ基因的重组腺病毒载体,pacⅠ酶切线性化充分暴露反向末端重复序列后,脂质体转染HEK293A细胞,借助GFP的表达可以在转染后的2～3天观察到包装病毒rAdeno-GP5-IFN-γ产生,7～10天出现病毒蚀斑。经PCR法及酶切证实各中间过程载体及最终的包装病毒中携带有目的基因,western-blot证实两基因在腺病毒中得到了表达。大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体rAdeno-GP5-IFN-γ,重组子能够在HEK293细胞中稳定扩增,病毒包装的成功为进一步研究PRRSVE蛋白的免疫效果及IFN-γ的作用奠定了基础。     

插入单个loxP位点的伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建

根据GenBank已发表的pEGFP－C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理, pSKLR-GFP-loxP与 PRV SH株基因组DNA共转染293T细胞,在BrdU 的筛选压力下,利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR 扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp,只有一个34bp的loxP位点,并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。     

小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

[目的]构建小鼠白细胞介素IL-35基因慢病毒表达载体并鉴定。[方法]通过PCR法扩增出小鼠IL-35基因片段,将其与经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1连接,构建慢病毒重组质粒pLVX-IL-35-IRES-ZsGreen1。用无内毒素试剂盒提取重组质粒后,将其与病毒包装所需的3个辅助质粒共转染到人肾胚(HEK)293T细胞中包装能表达IL-35的慢病毒颗粒。该病毒培养上清经浓缩后,梯度稀释法检测其滴度。用浓缩后的病毒感染HEK293T细胞,然后通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达并结合RT-PCR法检测IL-35基因在该细胞中的表达。[结果]IL-35慢病毒表达载体构建成功,包装的慢病毒滴度为1×109TU/m L,通过荧光显微镜和RTPCR检测发现IL-35在HEK293T细胞中表达。[结论]成功构建IL-35慢病毒表达载体且IL-35蛋白能在HEK293T细胞中过表达。     

含人β-内啡呔融合基因的腺病毒/腺相关杂合病毒载体的构建与鉴定

目的:构建含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒。方法:构建腺病毒穿梭质粒pDC312-DTREE,与骨架质粒共转染HEK293细胞,细胞内同源重组包装出腺病毒腺相关杂合病毒。PCR法鉴定病毒及TCID50法测定病毒滴度。杂合病毒感染NIH3T3细胞观察转基因的表达,ELISA法测定表达产物浓度。结果:穿梭质粒pDC312-DTREE经限制性核酸内切酶AatII及NotI酶切结果正确。PCR鉴定结果表明病毒DNA内有人β-内啡呔DNA序列,且无野生型病毒的污染,病毒滴度为1.29×1010PFUml。病毒感染细胞后第3d,细胞培养液内有高浓度的β-内啡呔。结论:成功构建了含人β-内啡呔融合基因的腺病毒腺相关杂合病毒,为进行下游相关研究奠定了基础。     

复制缺陷型人泡沫逆转录病毒载体构建和外源基因表达

在人泡沫逆转录病毒 (humanfoamyvirus ,HFV)原病毒全长克隆pHRSV13的基础上 ,缺失病毒基因组的env基因和bel基因 ,构建了一个表达标记基因neo和报道基因 gfp的重组人泡沫病毒载体质粒pGPSNI GFP。在与辅助质粒 p△GP共转染情况下 ,得到复制缺陷型的重组病毒颗粒GPSNI GFP。该病毒颗粒可以感染多种宿主细胞 ,将携带的外源基因整合于细胞染色体DNA上并实现表达     

基于逆转录病毒载体的外源基因表达系统的评价和应用

逆转录病毒表达系统是基因治疗研究和RNA干扰技术广泛采用的外源基因表达系统。文中以增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因的表达水平和稳定性为指标,比较逆转录病毒表达载体pQCXIN和pcDNA3.1(+) 表达质粒介导的外源基因在HEK293细胞和CHO-K1细胞的表达效率。病毒感染HEK293细胞和CHO-K1细胞的相对荧光强度 (Relative fluorescence intensity,RFI) 均约为对应的质粒转染细胞的2倍。多轮反复感染逆转录病毒表达载体能有效提高HEK293细胞表达EGFP的效率。HEK293细胞经4轮病毒感染后的RFI值较1次病毒感染HEK293细胞的RFI值约提高2倍。此外,逆转录病毒表达载体介导的外源基因表达的稳定性优于质粒转染的外源基因表达。采用携带人重组活性蛋白C (Recombinant human activated protein C,rhAPC) 基因的pQCXIN和HEK293细胞进一步验证了逆转录病毒载体介导的外源基因表达效率,构建了rhAPC表达水平为10~15 mg/(106 cells·d) 的HEK293细胞系。研究结果表明,逆转录病毒表达系统是有应用价值的介导外源基因在哺乳动物细胞高效表达的技术途径。     

白细胞介素6重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建特异性过表达大鼠IL-6基因的重组逆转录病毒载体,并在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾HEK293细胞中检测IL-6的表达。方法以大鼠骨髓间充质干细胞mRNA为模板,经PCR获得目的基因IL-6,将其定向克隆到逆转录病毒载体pSEB-3H中,构建重组逆转录病毒质粒pSEB—IL-6,经脂质体分别转染到PC12细胞和HEK293细胞中,应用Real—timePCR和ELISA的方法在mRNA和蛋白质水平检测IL-6的表达变化。继而用HEK293细胞中包装获得的含有pSEB—IL-6的病毒颗粒进一步感染PC12细胞,Real—timePCR检测,IL-6mRNA的表达水平变化。结果PCR电泳及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至逆转录病毒载体中,其基因序列与Genbank报道一致;Real—timePCR和ELISA结果均显示,逆转录病毒质粒pSEB—IL-6转染PC12细胞和HEK293细胞后,IL-6的表达水平较对照组显著上调;经pSEB—IL-6逆转录病毒颗粒感染的PC12细胞中,IL-6mRNA表达水平较对照组提高4倍。结论成功构建了特异性表达大鼠儿-6基因的重组逆转录病毒载体pSEB—IL-6,并获得了具有感染能力的逆转录病毒颗粒,感染真核细胞后可高表达IL-6,为进一步研究IL-6的功能及其在多种疾病中的免疫调节机制提供重要的分子手段。     

Repression of porcine endogenous retrovirus infection by human APOBEC3 proteins

It has been shown that porcine endogenous retrovirus (PERV) can infect human cells, indicating that PERV transmission poses a serious concern in pig-to-human xenotransplantation. A number of recent studies have reported on retrovirus interference by antiviral proteins. The most potent antiviral proteins are members of the APOBEC family of cytidine deaminases, which are involved in defense against retroviral attack. These proteins are present in the cytoplasm of mammalian cells and inhibit retroviral replication. To evaluate the inhibition of PERV transmission by human APOBEC3 proteins, we co-transfected 293T cells with a PERV molecular clone and human APOBEC3F or APOBEC3G expression vectors, and monitored PERV replication competency using a quantitative analysis of PERV pol genes. The replication of PERVs in cells co-expressing human APOBEC3s was reduced by 60–90% compared with PERV-only control. These results suggest that human APOBEC3G and APOBEC3F might serve a potential barrier function against PERV transmission in xenotransplantation.     

用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选有效的siRNA

 建立一种利用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选能有效抑制目的基因表达的siRNA的方法.以巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因为研究对象,筛选能有效沉默MIF表达的质粒载体介导的siRNA.构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的MIF-GFP融合表达载体pEGFP-MIF.分别将3个靶向MIF的siRNA表达质粒与pEGFP-MIF共转化HEK293细胞,在荧光显微镜下观察HEK293细胞中GFP的表达,并用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.同时,将MIF siRNA表达质粒分别与MIF表达载体共转化HEK293细胞,用荧光定量PCR检测HEK293细胞中MIF mRNA的表达水平.定量PCR结果显示,GFP表达低的细胞中,MIF mRNA的表达也明显降低;利用pEGFP-MIF和MIF表达载体筛选到的有效MIF siRNA的结果一致.因此,建立了目的基因与GFP融合表达,以GFP作为报告分子来筛选抑制目的基因表达siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案.     

猪骨髓基质抗原2基因的克隆、表达及生物学活性研究

研究目的是克隆猪骨髓基质抗原2(Bone marrow stromal antigen-2,BST-2)基因并进行真核表达,获得具有抗病毒活性的重组BST-2蛋白。研究通过RT-PCR从猪瘟弱毒疫苗和聚肌胞(Poly I:C)刺激的猪肾细胞(PK-15)中扩增出猪BST-2cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,构建重组表达质粒pcDNA-BST-2,转染HEK293T细胞,纯化BST-2蛋白并经Bradford法定量,Western blot检测,研究BST-2抗病毒生物学活性。酶切鉴定和核酸序列测定证实pcDNA-BST-2真核表达质粒构建成功,转染HEK293T细胞后,经间接免疫荧光能够检测到绿色荧光。生物学活性测定重组BST-2蛋白具有一定的抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)、H9禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)及猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,PRRSV)的活性。结果表明,重组BST-2具有一定抗病毒生物功能,为进一步研究重组BST-2蛋白的活性以及BST-2抗病毒药物研究奠定了基础。     

五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α1,3半乳糖会引起超急性免疫排斥反应,导致移植器官最终被移植受体排斥.除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有αGal半乳糖表达,但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面α1,3半乳糖表达的个体差异,本实验利用FITC-isolectin进行荧光标记,通过流式细胞术以及激光共聚焦分析,对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α1,3半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC-isolectin标记的最适浓度为25ng/μl(细胞标记效率大于85%).结果显示,14头猪外周血单个核细胞表面α1,3半乳糖的表达差异范围在1.25～2.09倍之间,远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.     

携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定

目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI。方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达。结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。     

第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探

目的:对目前最为常用的三质粒慢病毒包装系统进行优化,以期明确各质粒表达的病毒成分对提高慢病毒包装效率的重要性。方法:在限定总质粒量为10μg的情况下,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的目的质粒、表达gag/pol、Rev、VSVG的包装质粒按不同比例混合,转染293T细胞进行病毒包装,48 h后收集上清用于感染293T及K562细胞,72 h后经流式细胞术检测GFP+阳性细胞比例,分析所获病毒的感染效率。结果:采用不同的质粒混合比例包装的病毒感染效率具有明显差异,其中携带GFP的目的质粒量影响作用最为显著,当目的质粒量从15%(1.5μg)增至35%(3.5μg)时,GFP+293T细胞比例从14.2%升至45.1%,增加了3.2倍。当固定目的质粒量为35%,同时分别将表达gag/pol或Rev的质粒量从15%提高到25%时,改变Rev组的GFP+阳性率提升最明显,为1.5倍;而改变VSVG质粒量在已测试的混合比例中作用不显著。包装病毒感染K562细胞的结果与293T细胞类似。结论:通过对比包装病毒的感染效率,优化了慢病毒包装的混合质粒条件,并成功地应用于感染白血病细胞系;首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高病毒的包装效率,为利用慢病毒表达体系研究多种基因在血液系统中的功能奠定了技术基础。