肾移植术后HCMV感染与淋巴细胞亚群及肾功能的相关性

目的：肾移植患者由于术前透析及术后服用免疫抑制剂,显著增加了人巨细胞病毒（Humancytomegalovirus,HCMV）原发感染和潜伏感染被激活的机会。观察HCMV感染情况与血T淋巴细胞亚群及肾功能的变化,以探讨其相关性及临床意义。方法：跟踪收集40例肾移植患者术前、术后血标本,应用RT-PCR技术检测HCMV,流式细胞术检测淋巴细胞亚群,结合肾功能判断是否发生急性排斥或移植肾功能恢复延迟。结果：肾移植术后HCMV感染率为52．5％,10例出现症状性感染（25％）,出现阳性时间35．7±15．3天。症状性感染组CD3-bCD4＋的水平和CD4＋／CD8＋的比值较无活动性感染组和正常对照组均降低,CD8＋水平较其他组升高,差异有显著性意义（P〈0．05）。无症状性活动感染者与无活动性感染者各指标比较差异无显著性。活动性感染组急性排斥或移植肾功能恢复延迟发生8例（38．1％）,无活动性感染组发生1例（5．2％）,差异具有统计学意义（x^2=6．15,P〈0．05）。结论：肾移植术后HCMV感染能显著引起T淋巴细胞亚群变化,尤其是CD4＋／CD8＋。并与急性排斥或移植肾功能恢复延迟密切相关联,在其发生发展中可能起着重要的作用。三者相互联系、相互作用、互为因果,对进一步机制的研究及临床诊断治疗、预后方面有一定意义。     

HCMV感染抑制人海马神经干细胞分化

研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影响。体外分离、培养人海马NSCs,应用免疫荧光方法检测其NSCs标记物-巢蛋白(Nestin)的表达。10%胎牛血清诱导NSCs贴壁分化,同时用MOI为5的HCMV AD169株感染NSCs,7d后使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和HCMV即刻早期蛋白(IE)的表达,计算阳性细胞比率。本实验所培养的细胞(4～6代)95±8%表达Nestin;分化诱导7d后,感染组86±12%细胞表达IE,未感染组和感染组Nestin阳性率分别为50±19%和93±10%(t=6.03,P<0.01),GFAP阳性细胞率分别为81±11%和55±17%(t=3.77,P<0.01)。以上结果表明分化过程中的NSCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NSCs的分化。     

融合蛋白M-IL-2(~(88)Arg,~(125)Ala)在毕赤酵母中的表达及抗肿瘤活性研究

构建融合基因蜂毒肽(melittin)与人变构白介素2(M-IL-2(88Arg,125Ala))毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化毕赤酵母菌株KM71H,甲醇诱导筛选出的多拷贝阳性菌株表达融合蛋白,纯化融合蛋白,并进行初步的抗肿瘤活性研究。经测序及PCR鉴定,M-IL-2(88Arg,125Ala)正确插入pPICZαA中,电转化后,重组载体通过同源重组整合到酵母基因组中,SDS-PAGE检测在26 ku左右有明显目的条带,与理论相符。经Western blot鉴定具有较高抗原性及特异性。BCA法测定甲醇诱导96 h融合蛋白表达量达315.2 mg/L。CCK-8法检测融合蛋白对人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela细胞生长抑制作用,表明纯化的融合蛋白在体外能抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela细胞的生长增殖。该研究为融合蛋白M-IL-2(88Arg,125Ala)大规模制备和动物实验以及临床前期研究奠定了基础。     

Split-marker 重组技术构建泛素C 末端水解酶基因缺失菌株

目的:对烟曲霉(Aspergillus fumigatus)泛素末端水解酶(creB)基因进行敲除。方法:通过氨基酸序列分析软件初步分析烟曲霉CreB蛋白结构.利用split-marker重组技术构建重组片段,并通过PEG-原生质体方法对烟曲霉野生菌株进行转化,采用PCR方法对转化子进行筛选,最后选取初步筛选的转化子进行测序鉴定。结果:结构分析显示烟曲霉CreB蛋白具有泛素特异蛋白酶(ubiquitin-processing protease)UBP亚家族六个结构域。本实验构建了转化片段并转化,在抗性平板中获得了25个Hyg抗性转化子,进一步采用PCR方法筛选到20个转化子,最终通过测序分析获得一株creB基因缺失菌株。结论:Split-marker重组技术是对烟曲霉creB基因进行敲除的快速有效的方法。获得的creB缺失菌株可用于基因功能研究。     

HSV-1感染对人星形胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的:研究单纯疱疹病毒1型(Herpes simplexvires,HSV-1)感染对人星形胶质瘤细胞U251增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法:以感染复数(MOI)为5的HSV-1感染体外培养的U251细胞,在感染后24 h、48 h、72 h和96 h用倒置显微镜观察U251细胞的形态改变:用MTT法、流式细胞术观察HSV-1感染对U251细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响.结果:①U251细胞在感染24h后开始出现细胞融合,48 h后开始出现典型的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),72h后超过80%的细胞出现CPE,.96h后细胞大部分死亡.②MTT法显示HSV-1感染U251细胞24 h、48 h、72 h及96 h的U251细胞OD值均低于对照组(P<0.05).③HSV-1感染U251细胞12h后凋亡率与对照组无显著差异(P0.05),感染24h和36h后凋亡率比相应对照组有显著差别(p<0.05).④HSV感染12h、24h和36h后均可引起U251细胞S期细胞增多和G0/G1期细胞减少,24 h后G2/M期细胞比例开始增加.结论:HSV.1能感染体外培养的U251细胞,抑制其增殖,促进其凋亡并影响其细胞周期.     

基于主成分特征投影法建立利用16S rRNA基因序列进行物种分类方法的研究

提出一种有别于系统发育树的根据16S rRNA基因序列进行物种分类的新方法。首先将基因的碱基字母形式转换成数字形式,构建多维向量。然后根据主成分分析方法将该向量向数据分布最大方向投影,将原数据用几个“主成分”线性表出,而不丢失原数据的信息,采用主成分的显示功能作出三维主成分特征投影视图,达到分类的目的。在双歧杆菌和肠球菌的分类识别中得到较好的应用。     

人巨细胞病毒即刻早期蛋白IE2在Tet-On系统调控下的表达及其抗凋亡作用

即刻早期蛋白IE2是人巨细胞病毒(HCMV)感染后最先表达的蛋白质,具有调节细胞周期和抑制细胞凋亡的作用。但IE2蛋白的表达水平与其抗凋亡活性之间的关系尚不清楚。本实验通过建立Tet-On系统调控下表达HCMVIE2蛋白的细胞株,在不同诱导条件下检测IE2蛋白对细胞凋亡和p53表达的影响。结果发现IE2蛋白能抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,其抑制效应与IE2蛋白的表达量相关,而原位杂交结果显示IE2蛋白不影响p53的表达,提示IE2蛋白可能通过多种途径抑制细胞凋亡。     

一种白细胞介素2基因变构体的高效表达与纯化工艺

利用定点诱变技术构建表达质粒pET15b-MhIL-2并将其在大肠杆菌中进行表达发酵的优化研究,高效表达出可溶性的MhIL-2重组蛋白。蛋白经过亲和层析、Thrombin酶切、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,MhIL-2纯度达95%,且MhIL-2比hIL-2具有更强的促进T细胞增殖生物活性。     

HSV-1感染对神经胶质瘤细胞神经生长因子及其受体表达的影响

神经生长因子(NGF)主要由神经胶质细胞产生,通过特异的靶细胞表面的神经生长因子受体介导产生生物学效应,与神经细胞的生长发育、分化和凋亡等密切相关。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)作为一种嗜神经病毒,易造成神经细胞、神经胶质细胞凋亡或死亡。本实验以U251人神经胶质瘤细胞为研究对象,观察HSV-1感染致U251细胞凋亡的过程中NGF及其受体的变化情况。结果发现U251细胞是HSV-1的容许细胞;HSV-1感染致U251细胞凋亡过程中,NGF及其低亲和力受体p75NTR出现表达强度随时间先增强后减弱的趋势,而高亲和受体Tr-kA持续低表达。推测HSV-1感染致神经细胞凋亡中可能调控了神经营养因子的表达。     

HCMV基因在人和小鼠胚胎成纤维细胞中表达的差异性研究

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）种属特异性机制尚不清楚。研究通过检测HCMVADl69体外感染人胚胎成纤维细胞（Human embryo fibroblast, HEF）和小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryo fibroblast, MEF）后病毒基因的表达情况,探讨HCMV种属特异性的可能分子机制。首先用HCMV AD169（MOI=5）分别感染HEF和MEF,相差显微镜逐日观察细胞的形态学变化;RT—PCR检测HCMV即刻早期（IE1、IE2）、早期（uL84）和晚期基因（UL83）的表达情况;Western—blot和免疫荧光检测病毒基因编码蛋白表达的情况。形态学观察发现HEF感染HCMV后逐渐变大变圆并相互融合,第4天可见典型的HCMV特征性病变效应,而MEF则未出现上述的变化;RT-PCR和Western—blot表明HEF组表达即刻早期基因IE1和IE2、早期基因uL84和晚期基因UL83 mRNA以及各基因所编码的蛋白,且相对表达量显著高于模拟感染组（P〈0．01）;而MEF组仅IEl和IE2mRNA和蛋白相对表达量显著低于HEF组（P〈0．05）,而高于模拟感染组（P〈0．01）。免疫荧光检测发现HEF感染72h表达IE和UL83蛋白,而MEF则无明显表达。以上结果表明,HC—MV不能在MEF中复制并产生完整子代病毒颗粒,且病毒基因表达阻止在IE2基因表达之后和UL84基因表达之前,其种属特异性可能与即刻早期蛋白低水平的表达量有关。