双抗性质粒pSC33、pSC48的构建及其特性研究

截短的短小芽孢杆菌质粒pCJ3与去除了复制功能的金黄色葡萄球菌质粒PUB110经EcoRI酶切,DNA连接酶连接后组建T_o~r及K_m~r的双抗性的重组质粒pSC33和和PSC48。根据电泳迁移率估算pSC33及pSC48的大小分别为6.7及6.27Kb。具有BamHⅠ、AVaⅠ、XbaⅠ及BgLⅡ等限制酶的单切点,其中BgLⅡ切点位于卡那霉素抗性基因内。pSC33及pSC48能转化枯草杆菌各种突变体的感受态细胞,转化率比亲本质粒高一个数量级,也能转化枯草杆菌的原生质体。pSC33及pSC48在枯草杆菌BR151中表现稳定,以PSC48和载体克隆了滑鼠蛇肝线粒体DNA片段。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究 Ⅰ.多粘芽孢杆菌质粒的分离和鉴定

从多粘菌素E产生菌多粘芽孢杆菌中分离到两株药物抗性菌株,其中P19-4为双重抗生素抗性菌株(Ap~R、Sm~R),P250-2为多重抗生紊抗性菌株(Pen~R、Ap~R、Sm~R、Em~R、Tc~R、Nm~R、Cm~R、Km~R)。用吖啶橙消除质粒试验及亚硝基胍回复突变试验,初步证明抗生素抗性基因在质粒上,而决定多粘菌素E生物合成的基因可能在染色体上。用琼脂糖-溴化乙锭凝胶电泳分析在两株菌的DNA中鉴别出明显的质粒带,用电镜方法在两株菌的DN^制剂中均观察到共价闭合超螺旋和开放型环状两种构型的DNA分子。     

链霉素产生菌——灰色链霉菌质粒的分离和电镜观察

本工作首次从具有临床应用价值的抗菌素产生菌——灰色链霉菌中分离得到质粒DNA(SGP1),并经电镜观察证实。用琼脂糖凝胶电泳分析,初步证明灰色链霉菌和天蓝色链霉菌质粒DNA分子大小相似,限制性内切酶Eco R1对灰色链霉菌质粒DNA可能只有一个切口。电镜观察表明灰色链霉菌质粒DNA具有共价闭合超盘旋环状和开放形环状两种构型,根据经验公式计算,灰色链霉菌质粒DNA分子量为1．9x107道尔顿左右。经紫外分光光度计测定灰色链霉菌质粒DNA解链温度(Tm值)为80．8u℃ G—C克分子百分数为76．8％。我们所获得的灰色链霉菌质粒DNA(SGP1)是否即是前文报道的[10]经高温消除,并与链霉素生物合成有关的质粒,则尚待进一步证实。     

质粒分子量的电子计算机电镜测定

本文提出了用电子计算机测定电镜照片上环状质粒DNA长度的方法和计算机设计程序。并据此测定了从短杆菌中分离得到的未知质粒的分子量。     

嗜热链霉菌质粒的研究

从分属于12个种的28株嗜热链霉菌中检测到热灰紫链霉菌(S.thermogriseoviolaceus)T272带有3个质粒(pST1,pST2,pST3),热藤黄链霉菌(S.thermoluteus)T422带有1个质粒(pST4),经电镜观察得到证实,并按经验公式求得其分子量分别为27、8.3、6.9、25.7kb。实验数据表明,T272与利福平抗性有关的基因可能位于质粒pST1;而pST4可能与rRNA甲基化酶合成有关,推测该酶使T422具有红霉素、螺旋霉素、林可霉素抗性。未发现这些质粒与宿主的高温生长特性有关。     

大肠杆菌质粒RK8的分离及生化分析

耐药质粒RK8是从上海水域中的耐药大肠杆菌的RK8细胞中分出的,通过接合转移、转化、琼脂糖凝胶电泳及电镜测定,证明它是可转移的质粒,编码3″-羟基磷酸转移酶。由凝胶电泳可看出两种质粒区带,经电镜测定,根据周长计算,它们的分子量分别为:37.3×10~6,27.4×10~6道尔顿。将RK8与pBR322进行重组,其重组体带Km、Am、Tc三种抗性,分子量比RK8大。     

线形质粒

质粒是染色体外的遗传因子,是一种双链环状的DNA分子,质粒本身含有复制的遗传结构,能在细胞质中独立自主地进行自我复制。它是一个复制子。一些质粒也能整合到细菌染色体中随染色体的复制而复制。质粒一般都带有某些抗性基因。     

假单胞菌XN-1硝基苯降解性质粒的提取及研究

假单胞菌XN 1对有机污染物硝基苯具有降解性 ,并且对氨苄青霉素具有抗性。检测和提取了假单胞菌XN 1细胞内的质粒 ,得到了一个约 2 2kb大小的质粒pXN 1。质粒消除实验证实这个质粒与硝基苯降解性有关 ,而与抗生素抗性无关。XN 1和其自发突变株XN 1 2和XN 1 3特性的差异和质粒检测的差异之间存在对应关系 ,并且得到了一个比 pXN 1小几个kb的衍生质粒 pXN 1 3。     

链霉素生物合成有关质粒的研究——转化前后灰色链霉菌质粒的检测

本文通过凝胶电泳分析以及电镜的观察,检测灰色链毒菌质粒DNA转化前后的给体、受体和转化子中质粒的存在情况,结合链霉素合成能力的变化证明,链霉素产生菌——灰色链霉菌No.45(给体)中存在两个质粒pSG1(19×10~6道尔顿)和pSG2(2.3×10~6道尔顿)。高温消除质粒的、丧失合成链霉素能力的、气生菌丝受抑制的突变体No.45—3(受体)中只有pSG2,说明高温漓除的质粒是pSG1。以结霉素抗性为筛选标记,通过质粒DNA转化而重新获得合成链霉素能力的转化子TrNo.30(转化子)中,既检测到pSG2,也检测到pSG1。这就进一步证明与链霉素生物合成有关的质粒是pSG1,而不是pSG2。上述电泳分析结果又为电镜观察所证实。     

细菌抗药质粒中抗性基因的转座作用

ER275、ER396(Tc~r、Ap~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)与DR233、DR416(Tc~r、Cm~r、Sm~r、Su~r)是来自临床的抗药质粒。当带有这些质粒的菌株分别与大肠杆菌J5-3/R144drd3(Km~r)配对时,组成了两种质粒共存的菌株。用这种质粒共存的菌株作为接合转移的给体,并以Ap或Sm作为选择药物,得到ApKm或SmSuKm抗性类型的转移接合子,此种转移接合子能将ApKm或SmSuKm抗性作为一个单位连锁地转移到受体菌株,而且转移频率与R144drd3相似。 生化的研究表明,ER275、ER396质粒中的Ap抗性基因编码β-内酰胺酶,DR233与DR416质粒中的Sm抗性基因编码链霉素钝化酶,而带有Ap Km或Sm Su Km重组质粒的转移接合子也分别具有了合成这二种酶的能力。因此我们推测在ER275、ER396与DR233、DR416质粒中分别有可转座的Ap抗性基因与可转座的SmSu抗性基因存在。     

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。     

链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体的构建

本文报道了链霉菌和大肠杆菌穿梭质粒载体pSE-3的构建;把具有双启动子的大肠杆菌的质粒pGEM-3与新霉素抗性基因启动子缺失的链霉菌的探针质粒pIJ486分别用BamHI和BglⅡ酶切,T4 DNA连接酶连接后转化到E.coli HB101(Amp(?),Neo(?)),所得重组质粒能强启动pIJ486质粒上的氨基糖苷磷酸转移酶基因(aph),并使新霉素抗性基因在大肠杆菌中得到强表达。此重组质粒被命名为pSE-3,当其转化到变青链霉菌TK54(Tsr(?),Neo(?))的原生质体前,新霉素抗性基因亦能得到强表达。酶切结果表明,构建的具有两个启动子的穿梭质粒载体pSE-3上有HindⅢ和EcoRI的单酶位点,拷贝数约为39。经再转化和传代50代等研究表明,穿梭质粒载体pSE-3在链霉菌和大肠杆菌中均是稳定的。为某些有应用价值的目的基因在大肠杆菌和链霉菌中的克隆与表达提供了一个有价值的穿梭质粒载体。     

大肠杆菌抗药性质粒pFD3的链霉素抗性表达

Cohen等‘31研究大肠杆菌抗药性质粒R6 （此质粒携带卡那霉素、新霉素、氯霉素、四环 素、链霉素抗性）,发现在用卡那霉素抗性、新 霉素抗性或氯霉素抗性作为选择性标记进行转 化时,极少数转化子失掉链霉素抗性。本文报 道大肠杆菌抗药性质粒pFD 3（此质粒携带四 环素、链霉素、氯霉素、氨苇青霉素、磺胺抗性） 在经结合转移或转化途径传递给大肠杆菌C'₆₀₀ 时,所得的转移子、转化子中四环素、氯霉素、氨 苇青霉素及磺胺抗性都能正确表达,而链霉素 抗性则不能完全表达。     

三叶草素基因(tfx)在快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)H12-2中的表达与稳定性测定

将含有三叶草条基因的重组质粒pT2TFXK和pT2TX3K以接合转移的方式导入快生型大豆根瘤菌H12－2。转移接合子H12－2（pXK）能产三叶草素并具有抑菌活性;H12－2（P3K）表现出对三叶草素的抗性。抑菌谱试验结果表明：82％的供试快生型大豆根瘤菌菌株对三叶草素敏感;所有供试慢生型大豆根瘤菌则表现抗性。稳定性检测结果表明：在共生与人工培养条件下,导入的pXK和p3K质粒均可在宿主菌中稳定存在和表达。     

一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

基于全基因组测序的丁酸梭菌安全性评价

丁酸梭菌为革兰氏染色阳性专性厌氧菌,其主要代谢产物为丁酸,其次为乳酸、乙酸等有机酸,广泛分布于动物和人的肠道中。丁酸梭菌作为益生菌,在人以及动物的疾病预防、肠炎等疾病的治疗中均有良好的效果[1]。开展了丁酸梭菌全基因组测序,从耐药性、毒力基因、致病性等方面综合评价了丁酸梭菌的安全性能。结果显示,丁酸梭菌基因组DNA总长度4 709 567 bp,其中包含1条环状染色体DNA、1条环状质粒和2条线性质粒DNA。环状染色体DNA大小为3 873 131 bp,G+C摩尔百分含量为28.86%,环状质粒DNA大小为769 297 bp,G+C含量为28.33%,线性质粒1 DNA大小为49 922 bp,G+C含量为28.26%,线性质粒2 DNA大小为17 217 bp,G+C含量为27.89%。基因组中共检测到4 285个基因、87个tRNA基因、44个rRNA基因和3个sRNA基因;通过与CARD和ARDB数据库相比较,丁酸梭菌全基因组中未检测到数据库中已经收录的耐药基因及致病性相关基因的存在,分析结果为今后进行安全性评价试验奠定了基础。     

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p13W8的基础上,用分别携带p13W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒的根癌农杆菌,在不同处理条件下对粳稻3个品种进行共转化.试验结果显示,共感染混合液中pCAMBIA1300菌液比例高,抗性愈伤组织的转化频率也较高;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明,潮霉素抗性基因的阳性检测率为98%,反义蜡质基因的阳性检测率为68%.在105株转基因植株中,反义蜡质基因阳性株为30株,占转基因植株的28.6%.乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组;在乙酰丁香酮的各种处理中,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式.     

表达大肠杆菌分子伴侣GroEL、GroES和GrpE载体的构建及其应用

大肠杆菌（Escherichia coli）共表达系统常要求质粒具有不同抗生素抗性以及不同的复制子。利用粘性末端PCR技术,以含有大肠杆菌分子伴侣基因GroEL、GroES和唧E的pR—GESP质粒为模板,设计两对引物,通过两次独立的PCR反应扩增3个基因的多顺反子,将形成粘性末端的PCR产物插入NcoI和Xho1酶切的pACY．CDuet-1质粒,构建的pA—GESP质粒具有p15A复制子及氯霉素抗性,和具有ColE1复制子及卡那霉素抗性表达载体pET28b相容。SDS—PAGE显示含有pA—GESP质粒的大肠杆菌细胞中3个分子伴侣蛋白的表达水平和含有pR—GESP质粒的大肠杆菌细胞没有明显差异,它们对玉米丝氨酸消旋酶的可溶性表达有部分促进作用,但对N端含有组氨酸标签的玉米铁氧还蛋白还原酶的表达没有作用,在三个含有不同抗生素基因的质粒中共表达分子伴侣、5-氨基乙酰丙酸合酶和尿卟啉原III甲基化酶,两个酶连续催化的荧光产物在细胞内积累量为562．13±3．17／OD600,而没有分子伴侣的积累量为457．66±4．98／OD600,表明分子伴侣改善部分蛋白在大肠杆菌的可溶性表达和催化功能。     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/Hin dⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后加收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3．3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT－1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100％,解离后的质粒稳定性为93％。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL／neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg／ml的G418和300μg／ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。