益生芽孢杆菌对抗生素的敏感性及其质粒的检测

采用滤纸片抑菌圈法测定３０株益生芽孢杆菌对１５种抗生素的敏感性。结果９０％菌株抗磺胺嘧啶,对其余抗生素大部分菌株敏感。用改良碱裂解法提取３０株菌质粒,只有６１２９菌株含有一个大约４３ｋｂ的质粒,质粒消除实验证明该质粒与磺胺嘧啶抗性无关。     

嗜热脂肪芽孢杆菌抗药性质粒的转化

从堆肥和污泥中分得8株抗药性高温细菌,经电泳检查有质粒存在,对其中1株具有卡那霉素和链霉素抗性的嗜热脂肪芽孢杆菌T617-8的质粒DNA,用电镜测得分子量为26.6×10~6道尔顿。T617-8(Km~rSm~r)菌株经溴化乙锭处理后,对卡那霉素敏感,同时质粒消失。为此确证,卡那霉素抗性是由质粒所控制。以T617-8的质粒(Km~r)DNA,对消除质粒后的菌株(Sm~r)的原生质体进行转化,获得了抗卡那霉素和链霉素的转化子。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

北京动物园动物肠道菌携带抗药性质粒的分离

分离了254种动物的肠道菌,其中兽类127种、鸟类78种、爬行类33种、两栖类4种、鱼类12种。用5种抗生素进行抗性测定后,分离到271株抗性菌株。用接触转移实验测定,其中41株的抗性可以转移,抗性不能转移的菌株经SDS消除实验测定,结果有154株的抗性可以消除。将抗性能转移的菌株和10％的抗性不能转移但经SDS可以消除的菌株,用抽提DNA或制备溶菌物进行DNA琼脂糖凝胶电泳测定,除染色体带外,均有质粒带,说明这些可转移和消除的抗性都是由抗药性质粒所控制。其中P族质粒4个,能启动染色体转移的质粒4个。     

枯草杆菌和大肠杆菌间通过原生质体融合的质粒pHV33的转移

用带有质粒pHV 33(Ap~R Tc~R Cm~R,由大肠杆菌质粒pBR 322片段和金黄色葡萄球菌质粒pC194片段联接成的嵌合质粒)的大肠杆菌SK1592和枯草杆菌FD1980(trp~- Sm~R Rif~R)作为亲本,在DNase1始终存在的条件下制备原生质体,并经PEG诱导融合,在含Sm、Rif、Cm的高渗培养基上获得融合子。融合子在菌落形态、产芽孢、染色标记等十几项特征上都和枯草杆菌亲本相同,唯一相同于大肠杆菌亲本的便是质粒pHV33的Cm~R特征。用融合子的DNA抽提物转化大肠杆菌,获得Ap~R、Tc~R、Cm~R转化子。相反方向的转移没有成功。质粒pHV33在融合子和枯草杆菌中都较不稳定。和有关文献报道一致,质粒有关的抗性Ap~R、Tc~R和Cm~R在大肠杆菌中都能表达,但是在枯草杆菌中则只有Cm~R得以表达。     

苏云金芽孢杆菌质粒的检测及功能的初步研究

用改进的酶碱综合法检测了苏云金芽孢杆菌4个亚种11个野生菌株的内生质粒,获得良好的制备结果和重视性,对野生菌株YBT－1463及其无质粒突变株BMB171的形态和生理生化特性的比较研究结果表明,YBT－1463的内生质粒携带杀虫晶体蛋白基因,但不携带抗生素的抗性基因,且与该菌株对19种C源和12种N源的利用无关。     

益生芽隐杆菌对抗生素的敏感性及其质粒的检测

采用滤纸片抑菌圈法测定３０株益生芽直菌对１５种抗生素的敏感性。结果９０％菌抗磺胺嘧啶,对其余抗生素大部分菌株敏感。用改良碱裂解法提取３０株菌质粒,只有６１２９菌株含有一个大约４．３ｋｂ的质粒,质粒消除南粒与磺胺嘧啶抗性无关。     

双歧杆菌的耐药性与质粒

目的：研究双歧杆菌的耐药性与质粒的关系。方法 对１７株５种来自微生态制剂的双歧杆菌进行抗生素药敏试验和质粒检测,利用溴化乙锭消除其质粒;比较质粒消除前后耐药性的改变。结果１７株双歧杆菌对氨基糖式类和多肽类抗生素呈强抗性;除１株短型双歧杆菌Ｂ１５７存有２．７Ｋｂ和５．６Ｋｂ两种质粒外,其余菌株均未质粒,消除后持粒的Ｂ１５７株菌对抗生素的敏感性并未改变。结论 此１７株双歧杆菌的耐药性与质粒无直接相关性     

24株产不同抗生素的放线菌质粒的分离和鉴定

分离鉴定了中国微生物菌种保藏管理委员会保藏的24株产不同抗生素的放线菌的质粒。按改进的Kado和Liu快速法提取质粒DNA,经电泳、电镜的检测,在24株检测菌中的7株菌里分离出10个质粒,携带质粒的菌株约占检测菌株的29％。质粒DNA的分子量约为1.8—61.6 kb。通过消除质粒试验和致死接合(Ltz)反应,研究了质粒和抗生素产生的关系。     

沈阳地区铜绿假单胞菌药物敏感性测定及质粒图谱分析

目的 测定铜绿假单胞菌对22种药物的敏感性,帮助临床选择用药。并对分离株进行质粒图谱分析以了解耐药菌株的流行情况。方法 药物敏感性实验采用纸片琼脂扩散法,质粒指纹图谱分析采用碱变性法提取质粒DNA,限制性内切酶切割后进行凝胶电泳分析。结果 铜绿假单胞菌对头胞哌酮、氧派酸、丁胺卡那霉素、壮观霉素、多粘菌毒和头孢三嗪的敏感率在84％－100％之间。所有菌株对其他16种抗性素均有不同程度的耐药。质粒DNA图谱分析显示,12株被检测菌株中有11株含有质粒DNA,其中8株含有23kb质粒DNA。结论 铜绿假单胞菌对头胞哌铜、氟派酸、丁胺卡那霉素、壮观霉素、多粘菌素敏感;多数耐药菌株含23kb质粒DNA。     

体内遗传标记成团肠杆菌固氮质粒pEA9

用卡那霉素抗性（Kan^r)基因对成团肠杆菌固氮质粒pEA9进行活体遗传标记。将来自质粒pEA9的3.0kb片段(nif ENX)克隆到pBR322载体中,再将卡那霉素抗性(Kan^r)基因插入到3.0kb的片段中,构建成供体质粒pST5。将该质粒转化到含有待标记质粒pEA9的E.a.339菌株中,然后在AP培养基中消除供体质粒,筛选得到40个失去了pST5并保持卡那霉素抗性的克隆,分析表明它们不是质粒pEA9和pST5的共整合体,而是卡那霉素抗性基因通过两个质粒在nifENX区域内的DNA间的同源重组整合到了质粒pEA9上。     

胸膜肺炎放线杆菌萘啶酸抗性菌株的选育和信号标签突变株的构建

胸膜肺炎放线杆菌(APP)是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失.信号标签突变(STM)技术是在宿主动物体内鉴定病原菌毒力因子的高通量方法.通过体外传代选育出APP血清1型和3型萘啶酸抗性菌株,再以萘啶酸抗性菌株为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的E.coli CC118 λ pir或S17-1λpir为供体菌,在或不在E.coli DH5α(pRK2073)的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过抗性筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株.结果表明:体外萘啶酸加压传代很容易选育出萘啶酸抗性APP菌株,该抗性的产生与DNA促旋酶A亚基基因gyrA的突变有关.在APP与E. coli接合实验中,两亲本接合比三亲本接合操作更简单,效率也较高;APP不同菌株在接合和转座效率上存在很大差异,血清1型菌株高于血清3型菌株,3型标准菌株高于地方分离株JL03-R.本研究为APP STM突变体库的构建与毒力基因的鉴定奠定了基础.     

猪致病性大肠杆菌的质粒及染色体DNA指纹图谱分析

从长春、白城等地猪场母猪和发病仔猪肛拭标本中分离的75株大肠杆菌在系统鉴定和药敏试验的基础上进行了质粒指纹图谱和染色体DNA限制性酶切图谱分析,并对质粒谱和耐药谱的关系作了分析比较。 药敏试验结果表明:70株致病性大肠杆菌对12种抗生素的耐药率分别为4.3％～100％,每株菌平均耐药7种,最多耐药11种,最少为3种,分离菌株对多粘菌素B的耐药率最低,因此多粘菌素B可望是治疗仔猪大肠杆     

多重耐药铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及 对多粘菌素B耐药机制探讨

摘要：目的 探讨多重耐药铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因检测及对多粘菌素B耐药机制情况。方法 分析2008年2月至2014年2月收集分离的菌株收集200株铜绿假单胞菌,通过琼脂稀释法和E-test法对8种抗生素进行药敏试验,通过PCR对金属β-内酰胺酶基因进行扩增,在对多重耐药铜绿假单胞菌进行体外诱导,获得多粘菌素B的耐药菌株,观察临床分离株和诱导株pmrAB和phoPQ基因扩增和测序情况。结果 200株铜绿假单胞菌对于亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦耐药率均高于30%,200株铜绿假单胞菌对于阿米卡星耐药率最低仅为10%,敏感率最高达到90%。200株铜绿假单胞菌对于多粘菌素B药敏试验中197株敏感,3株中介,无耐药发生。通过B100、B108、B925三株临床分离株和多粘菌素B诱导耐药株B100d、B108d、B925d的phoP、phoQ和pmrB基因进行扩增。其中B108d号菌株的pmrB基因有两个点突变,在第5365842位的碱基发生了从GGC到AGC的突变,即361个G氨酸变成了S氨酸;第5365864位的碱基发生率从TCG到CCG突变,第368个S氨酸转变为P氨酸。B108d号菌株的1278614位点的碱基从TAC到TTC的突变,第84个Y氨酸变为F氨酸。另外B108d号菌株的phoQ基因中1278416-1278527位的基因发生缺失,进而缺失了152个氨基酸。结论 铜绿假单胞菌耐药率较高,但是没有出现多粘菌素B耐药菌株,诱导出的多粘菌素B耐药的多重铜绿假单胞菌PCR扩增后,出现了pmrB和phoQ基因的碱基突变,同时还有部分DNA片段缺失。     

λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvC敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株构建成功,spvC敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株,验证了spvC基因的功能。     

低温菌启动子探针质粒的构建

为了在宿主菌Acinetobacter sp.DWC6中构建低温菌蛋白表达载体,以pBR322质粒为基础,去除质粒上β-内酰胺酶基因的启动子片段,取而代之为来源于质粒pJRD215的卡那霉素抗性基因片段,并在pBR322中插入Acinetobacter菌属特异性ori的DNA片段,构建了能在Acinetobacter sp.DWC6和E.coli中正常复制的启动子探针质粒pBAP1。通过在质粒pBAP1中的β-内酰胺酶基因上游随机导入Acinetobacter sp.DWC6基因组片段,通过检测宿主细胞的氨苄青霉素抗性和β-内酰胺酶活性,来筛选强启动子片段,并分析了启动子探针质粒载体的功能及启动子的强度。     

有益芽孢杆菌受体菌研究

采用酸性茚三酮法测定了30株有益芽胞杆菌的赖氨酸产量,然后在不同的溶菌酶浓度下,对赖氨酸产量超过0．07g/L的21株菌进行原生质体转化质粒pUB110,测定原生质体形成率、原生质体再生率及转化频率,结果6103,6104,6120,6129四株菌的转化频率较高。最后,采用经典遗传学方法选育AEC抗性突变株,使赖氨酸积累提高。其中,B.licheniformis 6104诱变菌株610401能积累赖氨酸2．91g/L ,比出发菌株提高了17倍左右,转化率也提高了一个数量级。通过质粒的再转化试验及传代稳定性试验,进一步证实B.licheniformis 6104及其 突变菌株610401是较好的受体菌,尤其是用于赖氨酸合成酶基因的表达。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种cyt1 Aa基因在球形芽孢杆菌中表达

将编码cyt1Aa基因和 p2 0蛋白基因的DNA片段分别克隆连接于两个不同的穿梭载体 pBU 4和pMK 3上 ,构建了重组质粒 pBA 30和 pMA 6,通过电击法 ,将重组质粒分别转化 B .s野生株2 2 97,获得了转化菌株Bs 97 30和Bs 97 6。SDS PAGE和Westernblot分析证实了cyt1Aa基因在转化菌株Bs 97 30中获得了表达 ,而在转化菌株Bs 97 6中未检测到cyt1Aa基因表达的蛋白。转化菌株Bs 97 30中 ,cyt1Aa基因与B .s二元毒素基因同步于菌体生长的对数期起始表达 ,并持续至芽孢形成。生测结果表明 ,转化菌株Bs 97 30中cyt1Aa基因的表达并未明显增强其对敏感和抗性致倦库蚊幼虫的毒力。其原因可能是弱毒性的 cyt1Aa蛋白在转化菌株中的表达量不高。     

双歧杆菌质粒的检测及其对抗生素敏感性

本文应用ＬｅＢＬａｎｃ法提取６种２０株双歧杆菌菌株的质粒,发现共有４个种的６株菌株存在着１～３个质粒,多数质粒的分子量小于６．０ｋｂ。存在质粒的双歧杆菌包括分离自人的短双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双岐杆菌和婴儿双歧杆菌。用固体培养基滤纸片抑菌圈法测定双歧杆菌对１５种常用抗生素的敏感性,结果表明,测试的２０株双歧杆菌菌株对所检测的１５种抗生素的敏感性无规律可循,而且质粒消除实验表明质粒的存在与所检测的抗生素抗性无相关性。     

氧化硫硫杆菌质粒的分离

用碱法对分离到的7株氧化硫硫杆菌进行质粒检测,在6株中分离到了18个质粒,质粒DNA的分子量为1.3×10~4-98×10~6。