γ射线对小鼠调节性T细胞功能及相关细胞因子的影响及其意义

调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）及相关细胞因子在机体免疫平衡的调节中发挥重要作用,而其在放射免疫损伤中的作用尚不明确.本实验以6Gyγ射线照射C57BL/6小鼠,于照射后1～28d不同时间,检测外周血、胸腺和脾脏Treg细胞亚群及血清中细胞因子IL-2,IL-10及TGF-γ含量的变化,以探讨其在放射免疫损伤中的作用机制.结果显示,小鼠经6Gyγ射线照射后各组织CD4＋CD25＋Treg细胞比例明显增加（P〈0.05或P〈0.01）,胸腺CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞比例于照后1d即明显增高（P〈0.01）,而在照后7d明显低于未照射组（P〈0.01）;血清抑制性细胞因子IL-10（7d）,TGF-γ（3d）含量明显增高（P〈0.05）,而IL-2浓度持续降低.本文揭示了Treg细胞及其相关细胞因子与辐射所致免疫功能受抑和免疫调节功能失衡密切相关,为进一步的辐射损伤机制研究奠定基础.     

反相高效液相色谱法分析聚乙二醇修饰的水蛭素

目的：采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对聚乙二醇（PEG）修饰的水蛭素进行分析分离,用以分析修饰产物中不同修饰度水蛭素的组成和比例。方法：色谱柱为Hypersil C18,5μm,4.6mm×150mm;流动相A为H2O＋0.01％的三氟乙酸,流动相B为乙腈＋0.01％的三氟乙酸。40min内由10％-50％流动相B进行梯度洗脱,洗脱流速1mL／min,上样量50μL,检测波长为214nm。结果：在单甲基化PEG-丙酸琥珀酰亚胺和水蛭素摩尔比不同的的反应产物中,PEG1-水蛭素、PEG2-水蛭素均可以达到基线分离,且不同批次的反应产物进行RP-HPLC的重复性良好。结论：RP-HPLC可以有效地对PEG修饰的水蛭素产物进行分析分离,为PEG化水蛭素的长效、缓释剂型的开发提供技术支持。     

重组腺病毒Ad-GFP的纯化

目的：用色谱法纯化制备携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。方法：采用5L生物反应器悬浮培养HEK-293N3S细胞进行病毒的扩增,冻融法裂解细胞,通过超滤、Source15Q离子交换层析和Sepharose4Fast Flow凝胶过滤层析进行分离纯化,采用分光光度法和高效液相色谱法分析重组腺病毒产品的纯度,采用组织培养半数感染剂量方法测定病毒的感染滴度。结果：通过两步色谱层析得到产品,经分光光度法分析,其D260nm/D280nm比值为1.21,高效液相色谱法分析其纯度达96.5%,产品滴度为1.0×1011U/mL,病毒颗粒数为1.76×1012/mL,比活性为5.68%。结论：确定了稳定可行的重组腺病毒色谱分离工艺,得到的产品在纯度、滴度和比活性等方面均符合国家食品药品监督管理局的标准。     

重组质粒pUDKH工程菌库的制备及检定

目的:pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。为了生产制备重组质粒pUDKH,须建立菌种库并对其进行质量检定。方法:将质粒pUDKH转化大肠杆菌DH5α,经筛选后制备成初始菌种库和工作菌种库,对菌种进行革兰染色、电镜、抗生素抗性、遗传稳定性、质粒拷贝数、生化反应等检定。结果与结论:菌种生产pUDKH的产量较高,无支原体及其他微生物污染,40代次内菌种性状、遗传稳定性、质粒拷贝数均稳定,可作为工艺生产用菌种。     

重组质粒pUDKH的质量分析

目的:分析研究pUDKH的质量。pUDKH是由本实验室构建的携带人肝细胞生长因子(HGF)基因的真核表达质粒,具有治疗肢体动脉闭塞病的应用潜能。方法:用光密度法分析pUDKH的浓度及纯度;用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋pUDKH比例及RNA;以地高辛标记的核酸探针固相斑点杂交法测定残留宿主DNA含量;用酶联免疫法测定残留宿主菌蛋白;以4组限制性内切酶分析一致性;PCR扩增目的基因片段;抑菌圈测定板测定残余抗生素;用鲎试剂检测细菌内毒素;对CHO细胞进行基因转染;ELISA检测上清HGF表达量;用Transwells法分析表达的上清液诱导ECV304细胞迁移数。结果:03批次pUDKH的浓度为1.97mg/mL,D260nm/D280nm值为1.84,超螺旋pUDKH比例为95.5%;电泳图谱中未见RNA;残留宿主DNA含量低于质粒DNA的0.2%;菌体蛋白质残留含量低于质粒DNA的0.1%;限制性酶切图谱与自行制备的对照品一致;PCR扩增到HGF基因片段,长约2.2kb;未见残余抗生素(卡那霉素)抑菌圈;细菌内毒素≤0.03125EU/mL;转染的CHO细胞上清HGF表达量为39.32ng/mL;表达的上清诱导ECV304细胞迁移数高于对照组2倍。结论:03批次pUDKH的质量符合药学规格。     

低氧条件下白藜芦醇对HepG2细胞增殖及自噬的调节作用及初步机制

白藜芦醇（resveratrol）是天然存在于葡萄、红酒及花生等中的一种多酚类化合物,具有抗癌、抗氧化等作用．目前针对resveratrol抗癌作用的研究大多侧重于常氧状态,而对于更接近体内肿瘤生长环境即低氧状态的研究相对匮乏．本文以肝癌细胞HepG2为模型,探讨了低氧（1％02）条件下resveratrol抑癌的相关功能和机制．结果表明,在低氧状态下resveratrol不仅抑制HepG2细胞的活性,而且也促进了低氧诱导的自噬保护机制;进一步研究发现,去乙酰化酶Sirtl和鞘氨醇激酶SPKl也参与上述过程．本文初步揭示了低氧状态下癌细胞对resveratrol敏感性低的可能机制,更加明确resveratrol在实体瘤中的抗癌作用,并为resveratrol的药物研发提供了借鉴．