一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

短小芽孢杆菌抗药性质粒pCJ3的分离及分子特性的研究

从短小芽孢杆菌中分离出具有四环素抗性的质粒pCJ3,经抗性消除试验、转化活性测定、琼脂糖凝胶电泳分析和电镜观祭等方面试验得到证实。电镜观察表明pCJ3质粒DNA分子具有共价闭合超螺旋环状和开放型环状两种构型。根据经验公式计算其分子量为4.33×106。     

脂肪嗜热芽孢杆菌质粒pFD101的限制性内切酶图谱

从脂肪嗜热芽孢杆菌T525中抽提得到的隐蔽性质粒pFD101,经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,确证为cccDNA。经测定,pFD101的分子量为3.83×10~6道尔顿。具有限制酶HindⅢ切点1个、SalⅠ和HpaⅡ切点各2个,没有EcoRI、BamHI和PstⅠ切点。根据限制酶片段的分子量作出了pFD101的简单酶切图。     

双功能质粒的构建与功能表达

将大肠杆菌抗四环素、氨基苄青霉素、氯霉素质粒pBR325和金黄色葡萄球菌/枯草杆菌抗新霉素、卡那霉素质粒pUB110,在体外经限制性内切酶EcoRI和T4 DNA连接酶作用,进行重组,获得了重组质粒pMM 1。pMM 1兼有抗四环素、氨基苄青霉素、卡那霉素和新霉素以及对氯霉素敏感的特性;用凝胶电泳法测定分子量,证明pMM1确为pBR325和pUB110两者的重组质粒。pMM 1在大肠杆菌中的转化频率为每微克DNA 0.79×10~3个转化子,在枯草杆菌受体中为每微克DNA 0.15×10~2个转化子。pMM1不仅能分别在大肠杆菌和枯草杆菌两种受体中复制,而且能同样表达,其抗药性水平为:对氨基苄青霉素不小于每毫升160微克,对四环素不小于每毫升120微克,对新霉素、卡那霉素不小于每毫升80微克。此外,用同样的方法构建了pBR 322和pUB 110的另一个重组质粒pMM 2,也获得了类似的结果。     

带有启动子DNA的片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

用限制性核酸内切酶EcoR1酶切枯草芽孢杆菌168染色体DNA和pPL603质粒DNA然后用T4DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BR151感受态细胞。在每毫升含有10微克氯霉素的SBPY选择培养皿上筛选,得到61个抗氯霉素的转化子。经快速琼脂糖凝胶电泳检测,从61个抗性转化子中得到49个比原载体pPL603质粒分子量大,并带有启动子DNA片段的重组质粒。测定了所有重组质粒表达的不同抗性水平,分析了部分质粒的一些特性,对抗性水平较高的7个重组质粒的分子量进行了测定,并用pBP61重组质粒DNA进行了第二次转化和酶切电泳分析。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆和启动氯霉素抗性基因表达

黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulosis virus简称AsGv)DNA和pPL603质粒DNA,用限制性核酸内切酶EcoR I酶切后,再用T4连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51感受态细胞。然后在loμg／m1氯霉素的sPBY选择平皿上筛选,得到了抗氯霉素的转化子。经过琼脂糖凝胶电泳检测,转化于中的重组质粒比原载体pPL603质粒分子量大。由于重组质粒上的抗性表达水平可达250μg／m1氯霉素,比pPL603质粒抗性表达水平(5μg／m1)提高50倍。所以重组质粒携带了有启动作用的DNA片段。启动功能片段的分子量,经琼脂糖凝胶电泳测定约为O．9kb。除进行DNA—DNA分子杂交确证外,并用重组质粒pAsGVPl5进行了第二次转化、抗性水平测定和分子量分析。     

食源性沙门氏菌耐药性检测及相关质粒

[目的]测定390株沙门氏菌的抗生素药敏性,研究部分多重耐药株中质粒与其宿主耐药表型之间的关系及其在接合过程中对耐药性水平转移的影响.[方法]使用选择性培养基分离到沙门氏菌并通过PCR确认后,按照琼脂稀释法测定分离株对供试抗生素的药敏性,试剂盒提取代表性多重耐药株中的质粒,HindⅢ酶切,DPS软件分析电泳后质粒图谱.通过接合试验研究质粒在抗生素抗性水平转移中的作用.[结果]沙门氏菌分离株对四环素耐药最为普遍(58.2%),其次为链霉素(42.8%)、卡那霉素(39%)和氨苄青霉素(38.2%),对头孢西丁、氯霉素、庆大霉素、头孢曲松、阿莫西林甲氧苄啶、头孢替呋钠和萘啶酮酸的耐药率分别为27.2%、26.9%、21%、19%、18.2%、17.9%、14.6%和12.3%.抗性质粒编码的相同或相似沙门氏菌耐药表型与其中所含的耐药质粒并不呈现出严格的对应关系.质粒携带的抗性基因可通过接合作用转移,接合效率在2.4×10-4到5.6×10-1之间.[结论]食源性沙门氏菌对常用抗生素的多重耐药已经成为普遍现象,抗性质粒的同源性与其宿主耐药表型无直接相关性,其携带的耐药基因可通过接合作用在不同细菌种属之间高频传递.     

北京动物园动物肠道菌携带抗药性质粒的分离

分离了254种动物的肠道菌,其中兽类127种、鸟类78种、爬行类33种、两栖类4种、鱼类12种。用5种抗生素进行抗性测定后,分离到271株抗性菌株。用接触转移实验测定,其中41株的抗性可以转移,抗性不能转移的菌株经SDS消除实验测定,结果有154株的抗性可以消除。将抗性能转移的菌株和10％的抗性不能转移但经SDS可以消除的菌株,用抽提DNA或制备溶菌物进行DNA琼脂糖凝胶电泳测定,除染色体带外,均有质粒带,说明这些可转移和消除的抗性都是由抗药性质粒所控制。其中P族质粒4个,能启动染色体转移的质粒4个。     

毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因的次级克隆和重组质粒的限制图

从我国引起仔猪腹泻的野生株E. coli 79-1454克隆了K88ac抗原基因,获得了重组体E. coli RR1(pNZ8801),分子量为10 Md。为了得到分子量更小的重组体,用E．coRI消化重组质粒,除去中间约3.2 Md的片段,得到次级克隆株E. coli RR1(pNZ8802),质粒分子量为6.8 Md。测定其K 88ac抗原为阳性,而且其产生的K88at抗原量略高于初级克隆株。电镜照片表明重组体表面长有菌毛。萤光抗体染色和猪刷状缘细胞粘附试验亦表明有良好的粘附生物活性。此重组体可以与本人克隆的K99抗原基因构建成复合重组体。本文还作了重组体的限制性酶切图。     

直组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8的纯化与鉴定

本文利用SDS-PAGE及蛋白质电泳印迹技术,从带有相应表达质粒的重组大肠杆菌裂解液中,将所表达的重组人嗜中性白细胞活化蛋白-1/白细胞介素-8(NAP-1/IL-8)转移至聚偏二氟乙烯膜上,直接进行N-末端15个氨基酸的序列分析,从而确证该目标蛋白得到高效表达和正确加工。随后采用Bio-Gel P30凝胶过滤层析和Mono-S阳离子交换层析对重组人NAP-1/IL-8进行了分离纯化,纯化产品达到SDS-PAGE纯。利用琼脂糖平板法测定了纯化产品的嗜中性白细胞趋化活性,推算其比活为2.8×10~5U/mg蛋白。又利用SDS-PAGE测出重组NAP-1/IL-8的分子量约为8.5kD,但根据凝胶过滤层析的洗脱时间推定,在溶液中确实存在分子量稍大于14.4kD的NAP-1/IL-8二聚体。     

医药其它

951686产生千酵母的重组人血小板生长因子的不兜全加工及其对生物学活性的髟响[英~/Calderon-Cacia,M.…/Biochem.Biophys.Res.Commun..1992,187(2).一1193~1199[译自DBA,1992,11(23),92-12987"1 利用质粒pYAGLTPB(14.9kb)转染的酿酒酵母MB2—1可生产人重组血小板生长因子BB同型二聚体(rhPDGF-BB),质粒中含有编码PDGF·B的cDNA序列。酵母转化细胞可有效地合成、加工和分泌具活性的rhPDGF—BB同型=聚体。利用凝胶电泳测定分泌的rhPDGF-BB,显现出一条比成熟生长因子的谱带模糊的高分子量谱带。抗高纯度PDGF-BB的单克隆…     

体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1和T4DNA连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

体外重组质粒pIB2及其性质的初步研究

本文报导了将大肠杆菌抗四环素质粒pSC101及抗卡那霉素、大肠杆菌素E1质粒pCR1,在体外经限制酶ECoR1 和T4DNA 连接酶作用,进行重组,经转化后,筛选得到了重组质粒pIB2。pIB2兼有抗四环素、卡那霉素和对大肠杆菌素E1免疫的特性。对pIB2 DNA 进行电泳和电镜观察,计算分子量证明pIB2 确为pSC101与pCR1的重组。测得pIB2的转化频率为4.0×10~(-6),每微克DNA 转化体数为4.2×10~4。pIB2对四环素和卡那霉素的抗药水平分别为每毫升25～30微克和200微克,并与pSC101和pCR1作了比较。限制酶Bam H1在原pSC101上具有一个切点而在pCR1上无切点,因而预计pIB2与Bam H1配合使用,可作遗传工程研究中双耐药标记的分子运载工具。     

嗜麦芽假单胞菌（P.maltophila）质粒的研究

本文用4种不同的方法对18株嗜麦芽假单胞菌是否含有质粒进行了检测,实验结果表明其中5株含有质粒。对其中的P2株不同生长期质粒存在状况的研究表明,该菌所含质粒与宿主不同生长期具有明显的相关性,其最高含量出现在稳定生长期,当细菌进入衰亡期时,其质粒量也随之减少,直至完全消失。 通过双向琼脂糖凝胶电泳、限制酶切分析以及分子量测定等方法,确定了嗜麦芽假单胞菌P2只含有1种质粒,分子量约为4.4×10~6道尔顿。有BamHⅠ、PitⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ单一酶切位点。该质粒可望进一步改建成十分有用的克隆载体。     

质粒在细菌致病性中的作用与新菌苗研制的展望

<正>一、质粒 1.基本性质:质粒是广泛存在于原核细胞中的一种复制子,是独立于染色体之外的双链超螺旋DNA,它的复制不受染色体的控制。它的存在与消失一般不影响细菌的存亡。只影响某些性状的有无。 细菌染色体的分子量约在10~9的数量级而质粒只有10~6左右,最大的也只有10~8数量级。根据质粒的大小,一般可分为     

链霉素产生菌——灰色链霉菌质粒的分离和电镜观察

本工作首次从具有临床应用价值的抗菌素产生菌——灰色链霉菌中分离得到质粒DNA(SGP1),并经电镜观察证实。用琼脂糖凝胶电泳分析,初步证明灰色链霉菌和天蓝色链霉菌质粒DNA分子大小相似,限制性内切酶Eco R1对灰色链霉菌质粒DNA可能只有一个切口。电镜观察表明灰色链霉菌质粒DNA具有共价闭合超盘旋环状和开放形环状两种构型,根据经验公式计算,灰色链霉菌质粒DNA分子量为1．9x107道尔顿左右。经紫外分光光度计测定灰色链霉菌质粒DNA解链温度(Tm值)为80．8u℃ G—C克分子百分数为76．8％。我们所获得的灰色链霉菌质粒DNA(SGP1)是否即是前文报道的[10]经高温消除,并与链霉素生物合成有关的质粒,则尚待进一步证实。     

庆丰链霉菌质粒DNA的分离及电镜观察

本文报道用清亮裂解液PEG沉淀法从庆丰链霉菌M-15菌株中分离到质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳用溴化乙锭染色及CsCl-EtBr密度梯度离心,在紫外线下观察均表明除了染色体带之外还有一条质粒带。我们摄制的电镜照片表明存在共价闭合超盘旋和开放环形两种分子构型,以多数大小相近的分子周长取平均值,按1微米=2.07×10~6道尔顿的公式计算,庆丰链老菌质粒DNA分子量约为10×10~6道尔顿。     

解淀粉芽孢杆菌赖氨酸-3基因在枯草芽孢杆菌中的克隆

限制性核酸内切酶EcoRI酶切解淀粉芽孢杆菌ASl.1099染色体DNA和质粒pUB lloDNA,T4 DNA连接酶连接,转化枯草芽孢杆菌BRl51(trpC2痢“B5 ly.f3 Neo')感受态细胞。用选择性培养基两次筛选,得到Neo‘和与BR 151 lys3营养缺陷突变互补的菌落。用快速测定质粒的方法检查,其中有13株转化子带有大小相同的重组质粒。分离其中l株转化子BRl51-29的重组质粒pB--L29 DNA,再次转化BRl51感受态细胞和原生质体。测定第二次得到的转化子性状,均与转化子B1~151-29相同。琼脂糖曩胶电泳检查这些转化子的质粒,其分子大小也与t组质粒pB--L29相同。以上试验证明,重组质粒pB--L29是由pUBll0和解淀粉芽孢杆蕾的咖3基因片段构成的。根据琼脂糖凝胶电泳测定pB--L29的分子量约为5.0kb,推断出l~,J3基因片段约为O.5kb。     

应用P_RP_L串联启动子和CIts857调控基因高效表达人γ干扰素

应用DNA重组技术,将去信号肽的人γ干扰素(HuIFN_γ)cDNA插到质粒p HE 6的P_RP_L启动子下游。该质粒含有CIts857抑制子基因。转化大肠杆菌DH5a后,通过升温诱导法,即将培养温度从30℃升到42℃,人γ干扰素cDNA可获得高效表达。分子量约为17.5kd,滴度可达2.4×10~3单位/升菌液。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的扫描表明,γ干扰素的表达量约占细菌可溶性蛋白总量的30％。对细菌生长与干扰素表达的关系做了动力学研究。本文对重组人γ干扰素的发酵生产提供了技术基础。     

铜绿色假单胞菌AS1.860中萘质粒的分离和鉴定

本文报道了一种新的萘降解质粒ND1.860。铜绿色假单胞菌AS1.860经碱-SDS裂解,氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心,得到质粒DNA。通过电子显微镜观察到环状DNA分子,并根据轮廓周长推算其分子量为38.1×10~6道尔顿。ND1.860经过EcoRI消化产生10个片段,HindⅢ消化产生9个片段,由琼脂糖凝胶电泳得到的限制图谱与已报道的萘质粒明显不同。