钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体的制备及鉴定

LipL32是钩端螺旋体外膜中含量最丰富的蛋白,有很好的免疫原性,且在致病性钩端螺旋体中高度保守。在非变性条件下纯化LipL32重组蛋白,与佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,取脾脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,然后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和有限稀释法分别进行筛选和细胞克隆,获得29株能稳定分泌抗LipL32单克隆抗体的杂交瘤细胞株,它们能识别8个LipL32抗原表位。用这些细胞株制备腹水型抗体,并对特性进行鉴定。用生物素标记这些抗体后两两配对,采用双抗夹心ELISA检测提取自15株致病性钩端螺旋体及其他致病菌的抗原,以评估单克隆抗体的灵敏度和特异度。筛选出1对灵敏度高和特异度好的单克隆抗体,ELISA检测rLipL32的最低浓度为1ng/ml。结果提示,该钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体及检测方法有很好的应用前景。     

鸭疫里氏杆菌多种血清型间接ELISA检测方法的建立

【目的】鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种重要的禽病病原,分为21个血清型。但一直缺乏一种针对多种血清型广泛适用的抗体检测方法。前期的研究表明,外膜蛋白A (Outer membrane protein A,OmpA)广泛存在于多种血清型的RA菌株中,是一种重要的免疫原性蛋白,并且其基因序列在RA血清型之间具有高度的保守性,提示其可以作为RA感染血清抗体检测的靶点分子。以重组蛋白OmpA建立间接酶联免疫吸附试验检测RA的抗体。【方法】通过诱导表达条件的摸索及蛋白纯化,获得适用于ELISA包被的重组OmpA抗原。通过Western-blot证明重组蛋白OmpA是否与RA多种血清型发生免疫学反应。进行方阵试验以确定ELISA抗原的最佳包被浓度、被检测血清的反应浓度。重复性、特异性和敏感性试验检查该方法的实用性。【结果】实验证实加入1%乙醇的诱导培养基有利于重组蛋白的可溶性表达。Western-blot结果表明,重组蛋白OmpA可以与1、2、6、10、11、13、14和17型多种RA主要流行血清型有良好的免疫反应性。经方阵试验确定抗原的最佳包被浓度为8 mg/L,待检血清的最佳稀释度为1:160。所建立检测方法具有良好的重复性、特异性和敏感性。【结论】实验建立的鸭疫里氏杆菌多种血清型间接ELISA检测方法可以用于免疫后抗体消长以及感染性抗体的检测。     

波摩那型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因片段的克隆表达

目的　构建L3 2_pGEX_5x_2重组质粒 ,诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL3 2。方法　PCR获取编码LipL3 2的基因片段 ,构建重组克隆载体和表达载体 ,转化受体菌 ,诱导表达重组LipL3 2蛋白。将重组LipL3 2蛋白和钩体抗血清进行Western_blot。结果　扩增出约 750bp的LipL3 2成熟蛋白基因 ,LipL3 2基因插入pGEX_5x_2表达载体 ,表达产物谷胱甘肽S_转移酶 (GST ,2 6× 10 3)与LipL3 2蛋白的融合蛋白的相对分子质量约为 53× 10 3 ,与预期大小一致。Western_blot显示重组LipL3 2蛋白能与钩体抗血清特异结合。结论　LipL3 2蛋白能在大肠埃希菌中表达 ,重组LipL3 2蛋白具有免疫反应性     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原域的高效表达及间接ELISA方法的初步建立

重组质粒pET-2e转化宿主菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导表达,比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量,确定其最佳表达条件,使外源基因获得了较高水平的表达,可达茵体蛋白总量的36．6％。Western-blot检测表明表达产物具有良好的免疫反应原性。将收集的纯培养物进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定了目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度,初步建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测,结果显示：使用囊素与疫苗共同免疫猪的血清抗体水平明显高于未加囊素组猪的血清抗体水平,与以往的报道一致,为以CSFV重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法的标准化奠定基础。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列（AB020025）针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a（＋）载体中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测LA0301的特征。构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性。酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体。结果生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域。克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000。在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白。结论LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒S蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种快速、特异、敏感的检测血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体的方法。【方法】利用生物学软件对PEDV S蛋白进行抗原位点分析,选择S蛋白的主要抗原表位区进行原核表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,经过条件优化、特异性和重复性试验,建立一种针对血清中PEDV抗体的间接ELISA检测方法。【结果】表达了重组S蛋白,重组的S蛋白能与PEDV阳性血清发生特异性反应,并建立一种基于重组S蛋白的间接ELISA检测方法。组内及组间变异系数均小于10%,重复性较好。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PEDV抗体检测试剂盒和Western-blot鉴定结果相比,两者符合率分别为86.67%和88.89%。【结论】建立的间接ELISA方法可以用于PEDV抗体的检测。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细