EB病毒特异性增强子CAT报告质粒构建策略

构建携带EB病毒特异性增强子oriP不同结构域的CAT报告质粒,以探讨EB病毒特异性增强子与EB病毒核抗原-1结合后的转录增强作用。聚合酶链反应扩增得到增强子oriP全序列,借助于pUC19质粒将其不同结构域克隆到pCAT3 Promoter(pCAT3／P)载体。扩增获得oriP全序列;构建得到携带EB病毒特异性增强子Orip不同结构域的CAT报告质粒pCAT3／P-oriP、pCAT3／P-FR、pCAT3／P-DS、pCAT3／P-(FR DS),质粒中目的基因的插入方向经鉴定正确。     

钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体的制备及鉴定

LipL32是钩端螺旋体外膜中含量最丰富的蛋白,有很好的免疫原性,且在致病性钩端螺旋体中高度保守。在非变性条件下纯化LipL32重组蛋白,与佐剂混匀后免疫BALB/c小鼠,取脾脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,然后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和有限稀释法分别进行筛选和细胞克隆,获得29株能稳定分泌抗LipL32单克隆抗体的杂交瘤细胞株,它们能识别8个LipL32抗原表位。用这些细胞株制备腹水型抗体,并对特性进行鉴定。用生物素标记这些抗体后两两配对,采用双抗夹心ELISA检测提取自15株致病性钩端螺旋体及其他致病菌的抗原,以评估单克隆抗体的灵敏度和特异度。筛选出1对灵敏度高和特异度好的单克隆抗体,ELISA检测rLipL32的最低浓度为1ng/ml。结果提示,该钩端螺旋体外膜蛋白LipL32单克隆抗体及检测方法有很好的应用前景。     

1组曲霉单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定一组抗曲霉不同抗原的单克隆抗体。方法采用烟曲霉细胞壁抗原成分、分泌抗原和灭活分生孢子,分别免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体,免疫荧光法鉴定单克隆抗体与曲霉属和念珠菌属抗原的交叉反应。结果获得29株稳定分泌抗曲霉单抗的杂交瘤细胞株,其中用烟曲霉细胞壁抗原成分免疫获得11株,用分泌抗原免疫获得13株,用孢子免疫获得5株;Ig亚类鉴定,11个克隆株为IgG1亚类,3个克隆株为IgG3,15个克隆株为IgM。免疫荧光法鉴定29株单抗特异性识别烟曲霉细胞壁抗原,与其他曲霉抗原有交叉反应。结论29株单克隆抗体,对于建立侵袭性曲霉感染早期诊断方法、筛选曲霉保护性抗体以及研究抗体保护机制奠定了实验基础。     

血中检测SARS冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用

为明确严重急性呼吸综合症(SARS)冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用,通过微量中和试验及酶联免疫方法、间接免疫荧光法检测疑似病人恢复期血清(大于28天)中SARS-IgG抗体,确诊SARS患者。同时收集发病不同时期SARS及普通发热病人血清,利用酶联免疫方法检测SARS-CoVN蛋白,并与荧光定量PCR早期诊断方法相比较。共检测：广州地区2003年12月～2004．年1月新发4例确诊SARS患者不同时期的血液和咽漱液标本;恢复期血清SARS-CoV中和抗体阳性病人不同时期的血清46份;广州地区2003年1月～4月临床确诊SARS患者159例的血清和56例疑似患者血清;非SARS普通发热病人血清97份;正常人体检血清100份。结果：4例新发SARS患者的不同时期标本中,3例患者急性期血均检出N蛋白,优于常用的荧光定量PCR检测方法。46份SARS-CoV中和抗体阳性的血清标本,N蛋白检出率为100％。159例临床确诊病例中,发病早期5天以内SARS-CoVN蛋白的检出率为92．3％,随后呈现逐步下降的趋势,在发病第18天仍可检出。56例临床疑似患者发病早期也有23．2％检出率。而97例普通发热病人及100份正常人血清中均未能检测出SARS-CoVN蛋白。表明在血清中检测SARS冠状病毒N蛋白的方法敏感性和特异性都好,对SARS实验室早期诊断具有重要作用。     

重组B7—2腺病毒的构建及鉴定

经聚合酶链式反应扩增出鼠源性B7－2基因,克隆在pAdCMV中,将此重组载体与质粒JM17共转染293细胞,进行同源重组,并经聚合酶链式反应筛途、鉴定重组腺病毒,结果成功地构建了两株重组B7—2腺病毒,在293细胞中大量扩增此重组病毒,并对腺病毒上清进行空斑纯化和CsCL递度离心。空斑评价法测定纯化后两株重组mB7—2腺病毒的病毒滴度分别为4．2×109PFU／ml和3．6×109PFU／ml     

烟曲霉抗原及实验诊断的研究进展

烟曲霉是多种医源性因素导致的机会性,严重深部真菌感染的主要病原菌,烟曲霉病的早期诊断及防治是亟待解决的问题,目前,研究烟曲霉特异性抗原是发展早期诊断曲霉病方法的基础。