家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列（AB020025）针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a（＋）载体中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

猪源支气管败血波氏杆菌百日咳杆菌黏附素基因的原核表达及其抗体检测ELISA方法

[目的]以猪源支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的原核表达产物为抗原建立检测PRN抗体的间接ELISA方法.[方法和结果]利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统对PRN基因在大肠杆菌中进行融合表达.SDS-PAGE和Western blot检测证实该基因获得高效表达,产物易于纯化且具有良好的免疫学活性.通过凝血酶酶切GST-PRN并回收,获得不含GST载体蛋白的PRN蛋白片段.以PRN蛋白片段为抗原建立检测天然PRN抗体的间接ELISA方法.该方法对猪巴氏杆菌病等7种常见细菌性疾病阳性血清的检测结果均为阴性,其敏感性比乳胶凝集试验提高4～128倍,能检测到人工感染14 d后的仔猪血清抗体IgG,对临床送检的1,229份猪血清的检测阳性率为32.7%.ELISA方法对阳性猪场的监测结果预示了保育期仔猪的合群导致猪群大量感染支气管败血波氏杆菌.[结论]该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于猪群PRN抗体水平监测和猪波氏菌病流行病学调查.     

检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。     

以重组P-gp为抗原建立检测MDR 1抗体间接ELISA方法的研究

目的:构建MDR 1基因原核表达质粒,表达P-gp重组蛋白,建立检测MDR1抗体的间接ELISA方法。方法:利用重组PCR技术扩增MDR 1基因的1kb片段,克隆至pET-28b（＋）中,构建原核表达质粒pETP-gp,转染感受态菌BL21（DE3）和BL21（DE3）plyss;以E.coli高效表达的P-gp基因主要抗原编码区重组蛋白为抗原,以HRP标记的兔抗人IgG为二抗,建立间接ELISA检测方法。结果:正确构建了pETP-gp原核表达质粒,并可在E.coli中高效表达,表达蛋白可用作检测MDR 1抗体ELISA抗原。结论:成功表达出重组蛋白P-gp,建立了检测MDR 1抗体的间接ELISA方法。     

鸭病毒性肝炎病毒VP1基因表达及其抗体检测ELISA方法的建立

[目的]研究DHV VP1基因在大肠杆菌中的表达,并以纯化的重组蛋白为抗原建立鸭病毒性肝炎抗体检测ELISA方法.[方法]采用RT-PCR技术,扩增VP1基因,与Pmd18-T载体进行连接,构建DHV VP1基因克隆重组质粒.然后定向插入到Pet-32a( )表达载体,筛选原核表达载体Pet-32a-VP1,进行ITPG诱导表达分析.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法并初步应用于临床.[结果]DHV VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达.Western blot检测表明,表达的重组蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应.确定间接ELISA方法的抗原最佳包被浓度为5 ug/孔,血清最佳稀释度为1:100,临界值为OD450值≥0.302,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性.通过对80份血清样品的检测表明,该方法与中和试验的符合率为97.5%,初步临床应用结果表明该方法可用于雏鸭母源抗体和免疫后抗体的消长变化的检测.[结论]以大肠杆菌表达的DHV VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于鸭病毒性肝炎抗体的检测.     

一种快速鉴定猪肺炎支原体免疫显性蛋白抗原的ELISA方法的建立

旨在建立一种快速鉴定猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)血清体液免疫显性蛋白抗原的方法。通过构建p GEX-6P-1-mhp366重组表达质粒并转入大肠杆菌BL21(DE3),将GST-Mhp366重组蛋白进行原核表达。将GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液加入谷胱甘肽包被板进行抗原包被,分别与17份Mhp阳性血清和13份Mhp阴性血清反应,通过对抗原包被量、封闭液、血清和二抗稀释度的优化,确定间接ELISA的反应条件。最终确定GST-Mhp366重组菌和GST工程菌裂解液原液为抗原的最佳包被量,PBS+10%FBS+2.5%脱脂奶粉为最佳封闭液,分别将血清按照1∶500稀释、酶标二抗按照1∶40 000稀释作为最佳工作浓度,从而建立了一种基于间接ELISA的快速鉴定Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原的方法,同时通过已知的血清体液免疫显性蛋白Mhp156和Mhp364对所建立的方法进行了验证。该方法的建立能够用于在基因组水平高通量筛选Mhp血清体液免疫显性蛋白抗原,并为Mhp初乳体液免疫和黏膜免疫显性蛋白抗原鉴定方法的建立奠定基础。     

猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA方法的建立

以猪细小病毒NS1抗原表位的真核表达及ELISA建立为目的,以猪细小病毒基因组DNA为模板,扩增获得PPVNS1主要抗原表位基因,将其插入到真核表达载体pPICZα-A中,获得重组质粒pPICZα-A-NS1。电转化后将重组毕赤酵母菌株诱导表达,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot实验表明表达产物具有良好的反应原性。将纯化后的重组蛋白包被酶标板,经棋盘法优化,初步建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为1.9μg/mL,血清最佳稀释度为1∶80,阳性判断标准定为OD待检血清>0.4且OD待检血清/OD标准阴性值>2.0。用该方法对猪血清样品进行检测,结果显示本方法与HI试验的符合率达91.2%,与国外同类试剂盒的符合率为92.1%,该间接ELISA方法特异性强、敏感性高,可用于猪细小病毒病感染抗体的检测。     

狂犬病病毒N蛋白主要抗原区的表达及SPA-ELISA抗体检测方法的建立

为有效监测免疫狂犬病疫苗后的抗体水平,以狂犬病病毒N蛋白的主要抗原表位所在区域N1蛋白为包被抗原,建立了SPA-ELISA抗体检测方法。用RT-PCR方法分别扩增出狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1区域 (1 000~1 353 bp),将二者分别克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,并将重组的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21(DE3) 中,经1 mmol/L IPTG诱导后进行免疫印迹分析。结果表明,重组的RV N和RV N1均以包涵体形式表达。与表达全长RV N相比,RV N1的表达量显著高于前者,且该重组蛋白同样具有良好的反应原性。用纯化的重组RV N1作为诊断抗原建立了检测犬RV抗体的间接ELISA方法。通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量是2 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,Protein A-HRP的稀释度为1∶4 000。用建立的ELISA方法对102份临床血清样品进行检测,与商品化试剂盒相比,二者的符合率为94.1％。试验结果表明基于主要抗原表位所在区域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗体水平的检测,为检测RV免疫抗体的ELISA试剂盒的研制奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌多种血清型间接ELISA检测方法的建立

【目的】鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种重要的禽病病原,分为21个血清型。但一直缺乏一种针对多种血清型广泛适用的抗体检测方法。前期的研究表明,外膜蛋白A (Outer membrane protein A,OmpA)广泛存在于多种血清型的RA菌株中,是一种重要的免疫原性蛋白,并且其基因序列在RA血清型之间具有高度的保守性,提示其可以作为RA感染血清抗体检测的靶点分子。以重组蛋白OmpA建立间接酶联免疫吸附试验检测RA的抗体。【方法】通过诱导表达条件的摸索及蛋白纯化,获得适用于ELISA包被的重组OmpA抗原。通过Western-blot证明重组蛋白OmpA是否与RA多种血清型发生免疫学反应。进行方阵试验以确定ELISA抗原的最佳包被浓度、被检测血清的反应浓度。重复性、特异性和敏感性试验检查该方法的实用性。【结果】实验证实加入1%乙醇的诱导培养基有利于重组蛋白的可溶性表达。Western-blot结果表明,重组蛋白OmpA可以与1、2、6、10、11、13、14和17型多种RA主要流行血清型有良好的免疫反应性。经方阵试验确定抗原的最佳包被浓度为8 mg/L,待检血清的最佳稀释度为1:160。所建立检测方法具有良好的重复性、特异性和敏感性。【结论】实验建立的鸭疫里氏杆菌多种血清型间接ELISA检测方法可以用于免疫后抗体消长以及感染性抗体的检测。     

兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌（Bb）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体（McAb）,用间接ELISA、Western-blot等方法对McAb特性进行鉴定。结果获得两株能稳定分泌抗Bb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A7D5和D6B2,其小鼠腹水抗体效价分别为1∶409600和1∶102400;且不与兔大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等兔的常见病原菌反应,特异性强。两株单抗亲和力实验表明A7D5亲和力略高于D6B2。ELISA相加试验表明它们针对相同的抗原表位。结论成功建立了两株能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价高、特异性强,为今后建立该菌的免疫检测技术建立奠定了基础。     

重组百日咳杆菌黏附素蛋白免疫小鼠可完全抵抗支气管败 血波氏杆菌的致死性感染

[目的]通过建立的小鼠呼吸道感染模型评价重组百日咳杆菌黏附素蛋白(GST-PRN)对小鼠的免疫保护效力.[方法和结果]在主动免疫保护试验中,GST-PRN免疫组小鼠能产生较高的PRN抗体水平,在使用3xLD50的支气管败血波氏杆菌HH0809株进行呼吸道气雾攻毒后,其保护率为100%(20/20),但载体蛋白GST和PBS对照组小鼠的存活率仅为15%(3/20)和20%(4/20).在被动免疫保护试验中,腹腔免疫GST-PRN兔抗血清能100%(10/10)保护小鼠抵抗10×LD50的HH0809株的腹腔攻击,但GST兔抗血清和PBS免疫组小鼠的存活率均为0(0/10和0/9).[结论]研究结表明重组PRN蛋白具有良好的免疫学活性,可作为亚单位疫苗或疫苗添加成分.     

兔抗麻雀IgY酶标抗体的制备

目的制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和纯化兔抗IgY血清IgG,,使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果硫酸铵盐析法粗提IgY,可去除部分杂蛋白,SDS-PAGE上分离后切下带有目的条带的凝胶,可以得到足够纯度的抗原,将带有IgY的凝胶作为抗原免疫后获得的抗血清经Protein-A纯化后,二抗在SDS-PAGE上鉴定,纯度达到99%以上。改良的过碘酸钠法标记获得的抗体浓度为1.008 mg/mL,ELISA检测酶标抗体效价为1∶1000。Western blotting鉴定抗体具有特异性。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY酶标抗体。     

Determination of an antigen suitable for enzyme-linked immunosorbent assay of the antibody to Bordetella bronchiseptica in guinea pigs

To establish an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique for the serological diagnosis of infections caused by Bordetella bronchiseptica (B. bronchiseptica) in guinea pigs, the authors recently assessed the usefulness of three antigen preparations derived from the bacterial cell components: sonication antigen (S-Ag), cell surface antigen (C-Ag) and lipopolysaccharide antigen (L-Ag). The use of S-Ag for ELISA resulted in the most sensitive detection of the antibody to B. bronchiseptica from guinea pig sera immunized with killed bacteria and sera derived from naturally infected guinea pigs. Like C-Ag, S-Ag was highly specific, showing no cross-reactivity with Pasteurella multocida. Assessment of antibody formations in animals with experimentally induced infection using the three antigen preparations revealed that the antibody to S-Ag was formed earlier than antibodies to the other two antigen preparations following growth of the bacterium in the lungs. These results indicate that ELISA with S-Ag as an antigen is a useful tool for the serological diagnosis of infection by B. bronchiseptica.     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立及初步应用

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/mL,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/mL,而血清最佳稀释倍数为1:80。阳性标准初步定为：OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0。采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

兔出血症病毒VP60基因在昆虫细胞中形成病毒样颗粒及其特性

目的将兔出血症病毒（RHDV）VP60全长基因在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,验证重组蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）的能力及其生物学特性,探讨VLPs作为检测抗原及亚单位疫苗的潜力。方法用Bac-to-Bac系统体外表达RHDVVP60全长基因。以免疫荧光及Western blotting检测蛋白表达情况及确定蛋白最佳表达条件;免疫电镜观察VLPs形态,并对VLPs的血凝性、免疫原性进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析表明,表达的重组蛋白分子量大小约为68KDa,在免疫荧光、琼脂扩散、ELISA试验中均与RHD多克隆抗血清特异性反应;接种重组病毒的Sf9细胞裂解液在电镜下可观察到与RHDV形态相似的VLPs;该VLPs可凝集人“O”、“B”型红细胞,凝集可被RHD多克隆抗血清所抑制;含VLPs的Sf9细胞裂解液可不经纯化用作间接ELISA抗原,所建立的ELISA方法与进口商品化试剂盒相比,特异性良好,敏感性、检出率稍低;将含VLPs的细胞裂解液加氟氏佐剂免疫兔,HI效价可达1∶40,可经受致死量病毒攻击。结论RHDV-VLPs的获得及其良好的免疫原性,为RHD血清学检测试剂的标准化、亚单位疫苗研制应用奠定基础,同时在转移载体及RHDV受体方面研究亦有潜在应用价值。     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。