曼氏无针乌贼GT微卫星位点的筛选

采用链霉亲和素包被的磁珠富集法筛选曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)微卫星位点。试验样品来自舟山六横岛,提取4个样品的DNA混合成DNA pool,用限制性内切酶Sau 3A I酶切。接上接头后构建基因组PCR文库,用生物素标记的(GT)15探针筛选。将筛选获得目的片段进行PCR扩增,连接pMD18-T载体,转入DH5α感受态大肠杆菌里,扩大培养后PCR筛选阳性克隆。总共选取278个克隆,对120个经过检测含有插入片段的克隆进行测序,发现102个克隆含有微卫星序列,阳性克隆比率为85%。除去重复测序和侧翼链不足的序列,可以设计引物的微卫星序列有64条。     

磁珠富集法筛选实验豚鼠微卫星分子标记

目的直接从实验豚鼠基因组DNA中筛选获得微卫星分子标记。方法应用磁珠和生物素标记的微卫星探针与豚鼠基因组酶切片段杂交,捕获200～1000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD-18V载体中,转化到感受态细胞E.coli DH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。然后用PCR法进行筛选。结果从约2000个转化子中获得240个阳性克隆。对其中98个进行了测序,并成功设计豚鼠微卫星引物17对。结论经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得豚鼠微卫星标记。本研究获得的微卫星位点将成为豚鼠遗传学研究的有力工具。     

牦牛基因组微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理,用链亲和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)12、(CCG)8、(CAG)8、(TTTC)8退火结合的含有接头和牦牛微卫星序列的单链限制性酶切片段,获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pMD18-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建牦牛基因组微卫星富集文库。测序结果发现,阳性克隆率为77％(37／48),说明构建的牦牛基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库。牦牛富集微卫星文库的建立和牦牛微卫星的筛选将为下一步进行牦牛基因组结构的分析、牦牛遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究、标记辅助选择以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。     

东方粘虫(Pseudaletia separata(Walker))微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理,用包被链亲和素的磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)15、(GA)15、(GTT)12、(GAT)12、(TAGA)8 和 (GTGA)8退火结合的含接头和微卫星序列的单链粘虫基因组DNA限制性酶切片段,获得单链目的片段.经PCR扩增形成双链后连接到pGEM-T 载体上,再转化到DH5α热感受态细胞中,首次成功构建粘虫基因组微卫星富集文库.随机抽样(16次抽样,每库共12～114个克隆)测序发现,6个文库总的微卫星阳性克隆率30.07%,CA/GAT/GTT 等3个文库的阳性克隆率达到40%以上.单次抽样最高阳性克隆率达到56%.粘虫微卫星富集文库的建立和高多态性微卫星单拷贝位点的筛选将为粘虫的生态遗传学研究、连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究等提供大量遗传标记,对昆虫迁飞的分子生态研究也有重大意义.     

藏鸡微卫星文库的构建与微卫星标记筛选

通过磁珠富集法构建了藏鸡基因组微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析.将藏鸡基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头.用生物素标记的(CA)12探针与藏鸡基因组酶切回收片段杂交,捕获200～900 bp片段,随后将获得的片段连接到pMD 18-T载体上,转化至JM109中,成功构建藏鸡微卫星富集文库.从1200个转化子中获得了353个阳性克隆,随机挑选53个测序,根据测序结果成功设计了18对藏鸡微卫星引物,最终筛选出6个具有多态性的微卫星标记,其PIC值均大于0.5,同时可以用于研究藏鸡遗传多样性.实验结果表明磁珠富集法能够有效提高分离微卫星标记的效率.     

背角无齿蚌基因组(GT)n微卫星DNA特征

利用磁珠富集法筛选背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的微卫星分子标记,采用Sau3A1酶对完整DNA进行酶切,以生物素标记的(GT)15寡核苷酸探针从酶切片段中筛选微卫星序列.洗脱的杂交片段克隆到PGEM-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过菌液PCR筛选检测出阳性克隆进行测序.结果表明:在筛选的18...     

Dynal磁珠富集大熊猫微卫星标记

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与大熊猫基因组酶切片段杂交,捕获400—600bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pGEM-T载体中,构建富集微卫星序列的小片段插入文库。应用γ^32P标记的探针筛选文库,从2880个转化子中获得了260个阳性克隆。对54个序列进行了测序,并成功地设计了大熊猫微卫星引物37对。该方法能有效提高筛选微卫星标记的效率。     

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.     

黑斑原(鱼兆)微卫星DNA富集文库构建与鉴定

采用磁珠富集法,利用生物素标记的(CA)12寡核苷酸探针从黑斑原(鱼兆)基因组DNA MboI酶切的400—1000 bp片段中筛选CA/GT微卫星位点,洗脱的杂交片段克隆到pMD18-T载体上构建富集微卫星基因组文库后,通过PCR筛选检测出720个阳性克隆,占所有克隆的89.2%,从阳性克隆中随机选取139个进行测序,序列分析发现,124个克隆含有7个以上的重复序列,其中完全的为80个(64.5%),不完全的为40个(32.3%),复合的为15个(3.2%),重复次数范围为7—165次,平均为52次。在124条序列中共59条可以设计引物。     

四川梅花鹿(CAG)n微卫星文库构建

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针与四川梅花鹿基因组酶切片段杂交,捕获200～750 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接pMD18-T载体,再转化到感受态细胞JM109中以构建文库.通过PCR方法从(CAG)n文库中筛选阳性克隆,从576个转化子中获得了234个阳性克隆,对其全部进行序列测定,其中73个含有微卫星序列.除获得的目的微卫星序列(CAG)n外,还观察到(AG)n、(AT)n的重复序列.本研究表明,经过优化的磁珠富集法能够稳定、高效地获得四川梅花鹿微卫星标记.     

西北太平洋海岸带大弹涂鱼复合体的隐存种与进化历史

大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris间断分布于西太平洋海岸带东亚与马来西亚马六甲海峡,但马来西亚种群的分类地位尚存争议。研究使用线粒体ND5基因序列（718 bp）与核位点Rag1基因序列（1395 bp）对西北太平洋海岸带11个地点的45尾大弹涂鱼属鱼类进行系统发育关系重建,结果表明大弹涂鱼包括东亚与马来西亚两个单系群,两者形成姊妹群关系。GMYC分析、*BEAST物种树支持大弹涂鱼东亚谱系和马来西亚谱系是不同种。分子测定年龄分析表明大弹涂鱼东亚谱系与马来西亚谱系之间的分化时间为2.73百万年。因此,西北太平洋海岸带大弹涂鱼是复合体,包括两个物种:东亚种群是大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris sensu stricto,而马来西亚种群是隐存种Boleophthalmus sp.。大弹涂鱼与隐存种之间的物种分化可能是晚上新世冰期海平面下降产生的地理隔离以及间冰期洋流对基因交流的阻碍两方面相互作用的结果。       

铅、铬胁迫对大弹涂鱼血细胞遗传损伤的彗星实验检测

通过彗星实验研究重金属Pb、Cr对大弹涂鱼的外周血细胞的影响。用不同浓度的Pb、Cr对大弹涂鱼外周血细胞进行1 h的染毒后通过单细胞凝聚电泳检测DNA损伤情况。结果表明国标浓度的Pb（0.005 mg/L）、Cr（0.05 mg/L）对大弹涂鱼外周血细胞均无明显影响;而国标10倍、100倍和1000倍浓度的Pb或Cr胁迫均会造成血细胞DNA损伤,且离子浓度与血细胞DNA的损伤程度间均存在＂剂量-效应＂,即浓度越高,DNA损伤越严重。因此大弹涂鱼血细胞可作为评价重金属遗传损伤毒性效应的敏感性生物标志物。     

放射性锆在模拟海水、底质及海洋生物系统中的动态

研究了放射性锆(^95Zr)在模拟海水、底质及海洋生物间的迁移、消长的动态．结果表明,海水中^95Zr的比活度在最初4h内下降了90％以上,此后呈缓慢递减趋势;底质中^95Zr的比活度至48h达到最大值,随后逐渐降低;半褶织纹螺螺壳和螺肉的放射性百分比分别为68．7％和31．30％;大弹涂鱼的鳃、鳍、内脏、头骨、皮、脊柱和肌肉等组织的放射性百分比分别为22．80％、12、64％、34．82％、10．31％、4．48％、11．55％和3．71％．半褶织纹螺对^95Zr的积累比大弹涂鱼更强、^95Zr在海水、底质、半褶织纹螺和大弹涂鱼中浓度的大小顺序是：底质>半褶织纹螺>海水>大弹涂鱼、各分室中^95Zr浓度(即比活度)随时间变化的动态可用指数函数表达．     

长江口及其南部邻近地区大弹涂鱼种群遗传结构及种群历史分析

应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术及细胞色素b（Cytｂ）基因序列,分析了长江口及其南部邻近地区大弹涂鱼（Boleophthalmus pecinirostris）群体遗传结构及种群历史,结果显示这一区域大弹涂鱼群体的遗传多样性水平很高。（1）RAPD分析结果：从100个10碱基随机引物中筛选出30个多态性引物,对长江口九段沙湿地、浙江舟山定海、福建霞浦群体各20个体进行RAPD分析,3个群体分别获得236、270、274条带,共301个有效位点。3群体多态位点比例（P）、Nei基因多样性指数（H）、Shannon多样性指数（I）分别在93.02%—96.35%、0.3890—0.4219、0.5618—0.6044。分子方差分析（AMOVA）表明,大弹涂鱼群体间存在显著的遗传分化（Fst= 0.03004-0.03254,P<0.05）,但仅3.2%的遗传变异来自群体间。（2）Cytｂ基因序列分析结果：从采自九段沙、定海、霞浦及浙江慈溪的42尾大弹涂鱼样本中,共获得33个Cytｂ基因单倍型（序列长1 141 bp）。4群体的平均单倍型多样性（h）、核甘酸多样性（π）分别为0.9814、0.0048。4群体间的遗传分化指数Fst为0.00043—0.07814,仅1.93%的变异来自群体间（AMOVA分析）,而基因交流值却达14.50—30.79,群体间K2-P遗传距离为0.0040—0.0056,从而显示大弹涂鱼群体间没有发生明显的地理分化。以Cyt b基因序列构建的NJ树揭示4个群体的个体组成2个谱系,但这2个谱系与地理分布并不相关。中性检验、错配分析和网络亲缘关系分析皆表明大弹涂鱼群体有过种群扩张,扩张时间约在更新世末期的0.057—0.023百万年前。     

Two species of goby, Boleophthalmus pectinirostris and Scartelaos sp., as the new second intermediate hosts of heterophyid fluke in Korea

A survey was performed in order to determine the infection status of the metacercariae of heterophyid fluke in two goby species, Boleophthalmus pectinirostris and Scartelaos sp., collected from Gangjin-gun, and Shinangun, Sooncheon-shi, Jeollanam-do, Republic of Korea. A total of three metacercariae of Heterophyopsis continua was found in only one B. pectinirostris (10.0%) from Gangjin-gun. Heterophyes nocens metacercariae were detected in 24 B. pectinirostris (96.0%) and 14 Scartelaos sp. (63.6%) from Shinan-gun. Heterophyopsis continua metacercariae were found in 11 B. pectinirostris (44.0%) and 21 Scartelaos sp. (95.5%) from Shinan-gun. Stictodora fuscata metacercariae were detected in 18 B. pectinirostris (72.0%) from Shinan-gun. No metacercariae were detected in 20 B. pectinirostris from Sooncheon-shi. From the above results, this study is the first to prove that B. pectinirostris and Scartelaos sp. serve as the second intermediate hosts of some heterophyid flukes in Korea.     

苯并（a）芘对大弹涂鱼肝脏过氧化氢酶活性的影响

过氧化氢酶 (ＣＡＴ)是生物体内一种含巯基 ( -ＳＨ)的抗氧化酶 ,可与谷胱甘肽过氧化物酶一起 ,清除超氧化物歧化酶歧化超氧阴离子自由基(Ｏ2 - )产生的过氧化氢 (Ｈ2 Ｏ2 ) ,进而阻断可产生活性极高的羟自由基 (ＯＨ)的Ｈａｂｅｒ Ｗｅｉｓｓ反应 :Ｍ Ｏ2 - Ｈ2 Ｏ2 →Ｍ2 ＯＨ ＯＨ Ｏ2 (Ｍ 为金属离子 ) ,因而在生物体的抗氧化防御系统中占有重要地位[1 2 ] 。研究表明 ,包括ＣＡＴ在内的抗氧化防御系统的成分可由于氧化污染的胁迫而发生改变 ,尝试以这些抗氧化防御系统成分的变化作为氧化胁迫的生物指标的研究正在成为毒理学研究的…     

苯并（a）芘对大弹涂鱼肝细胞超微结构的影响

在实验生态条件下,研究不同浓度苯并(a)芘(BaP)暴露下大弹涂鱼肝脏细胞超微结构的变化。结果表明,暴露于低浓度(0．5mg·L^-1)BaP 7d,大弹涂鱼肝脏细胞内的细胞器受到不同程度的损伤,其中线粒体和内质网是受BaP暴露影响最明显的细胞器,细胞核也受到不同程度的影响,细胞质中脂滴也增加;而暴露于高浓度(5mg·L^-1)BaP 2h,不仅是线粒体和内质网,几乎所有细胞器都受到严重影响,细胞器严重退化,细胞结构遭到严重破坏。研究结果证实,BaP可对大弹涂鱼肝细胞内多种细胞器造成损伤,并且BaP浓度越高,损伤程度越严重。     

Complete mitochondrial genome of the mudskipper Boleophthalmus pectinirostris (Perciformes, Gobiidae): repetitive sequences in the control region

The mudskipper, Boleophthalmus pectinirostris (Perciformes, Gobiidae), is an amphibious gobioid fish. In this paper, the complete mitochondrial genome of B. pectinirostris was firstly determined. The mitogenome (17,111 bp) comprises 13 protein-coding genes, 22 tRNA genes, 2 rRNA genes and 1 putative control region. 130-bp tandem repeat was identified in the control region, which was almost identical among the 10 individuals examined, and three different frequencies of the repeat unit (five, six or seven) were found among these individuals.     

Undermethylated DNA as a source of microsatellites from a conifer genome.

Developing microsatellites from the large, highly duplicated conifer genome requires special tools. To improve the efficiency of developing Pinus taeda L. microsatellites, undermethylated (UM) DNA fragments were used to construct a microsatellite-enriched copy library. A methylation-sensitive restriction enzyme, McrBC, was used to enrich for UM DNA before library construction. Digested DNA fragments larger than 9 kb were then excised and digested with RsaI and used to construct nine dinucleotide and trinucleotide libraries. A total of 1016 microsatellite-positive clones were detected among 11 904 clones and 620 of these were unique. Of 245 primer sets that produced a PCR product, 113 could be developed as UM microsatellite markers and 70 were polymorphic. Inheritance and marker informativeness were tested for a random sample of 36 polymorphic markers using a three-generation outbred pedigree. Thirty-one microsatellites (86%) had single-locus inheritance despite the highly duplicated nature of the P. taeda genome. Nineteen UM microsatellites had highly informative intercross mating type configurations. Allele number and frequency were estimated for eleven UM microsatellites using a population survey. Allele numbers for these UM microsatellites ranged from 3 to 12 with an average of 5.7 alleles/locus. Frequencies for the 63 alleles were mostly in the low-common range; only 14 of the 63 were in the rare allele (q < 0.05) class. Enriching for UM DNA was an efficient method for developing polymorphic microsatellites from a large plant genome.     

苯并（a）芘对大弹涂鱼肝脏抗氧化酶活性影响的初步研究

在实验条件下,研究了不同浓度苯并(a)芘(BaP)暴露对大弹涂鱼肝脏内抗氧化酶-超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响.结果表明,不同浓度的BaP暴露对抗氧化酶活性产生不同程度的影响.低浓度组(3μg