人肝刺激因子基因5'-侧翼序列克隆和结构分析

为探讨人肝刺激因子(human hepatic stimulator substance,hHSS)基因表达调控的分子机制,分离人了hHSS基因组DNA,克隆其5'-侧翼序列4 890 bp,与GenBank比对后,将hHSS基因定位于人16号染色体.通过逆转录PCR(RT-PCR)和5'RACE确定hHSS基因转录起始位点,为进一步研究hHSS基因启动子活性及转录调控特点提供了必要的实验依据.     

草原红牛IGF-I基因5′调控区序列的生物信息学分析

胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因为多启动子基因,也是影响动物生长发育和肉用性状的重要候选基因.在克隆草原红牛IGF-I基因5′调控区1 954 bP的基因组序列基础上,利用生物信息学软件,分析了IGF-I 5′调控区的启动子结构;预测出评分在95分以上的转录因子结合位点有71个;分析结果没有发现CpG岛和TATA-box.研究结果为进一步研究IGF-I转录效率以及对草原红牛生长和肉用性状的影响奠定基础.     

团头鲂促性腺激素GtH Iβ亚基基因5′端启动子区克隆及表达载体构建

本研究利用改进的锚定PCR方法克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)促性腺激素Iβ(GtH Iβ)亚基基因5′端侧翼序列,并在生物信息学方法分析的基础上构建了荧光素酶质粒表达载体。序列分析结果显示:克隆得到的GtHIβ亚基基因5′端侧翼序列长度为479bp,其中包括TATA盒、ARE、PRE、ERE、SF-1、Ptx1等可能对GtH Iβ亚基基因转录调控起重要作用的功能转录因子结合位点。利用PCR方法在基因组中扩增得到了3个缺失片段,并同全长片段一起分别连接至pGL3-Basic报告基因载体,成功构建了团头鲂GtH Iβ亚基基因5′端侧翼序列的表达载体,为进一步研究、分析其转录调控机制提供了基础。       

用S1核酸酶作图法测定蓖麻蚕18S rRNA基因的5′端位置

测定基因5′端位置是研究基因转录调控的一个重要前提。本文将蓖麻蚕18S rRNA基因DNA的5′端用~(32)P标记,然后与18S rRNA杂交,再用S1核酸酶水解掉非杂交区的DNA和RNA。分析放射自显影的结果,测出18S rRNA基因5′端的位置。在18S rRNA基因的BglⅡ_2位点向EcoRⅠ,方向延伸约220bp处,从这一结果,可知道蓖麻蚕rRNA基因的转录方向是5′EcoRⅠ_2→BglⅡ_23′。     

鸡生长激素基因5′端部分调控区的克隆分析

利用PCR技术扩增、克隆、测序了7个跨越不同生长速度的鸡品种(系)的生长激素(GH)基因的5′端部分调控区。这7个品种(系)分别为:高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋兼用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为760bp,包括了转录起始位点5′端侧翼区的473bp、两个可能的TATA框、组织特异性转录因子结合位点、第一个外显子和部分第一内含子。所有克隆的鸡GH基因5′端调控区与Tanaka发表的序列相比,均在-34碱基的位置上缺失一个胞嘧啶C,在 160与 161碱基之间多1个胸腺嘧啶丁,在 175碱基的位置上出现了以腺嘌呤A替换了鸟嘌呤G的情况。7个品种(系)之间的比较显示,鸡GH基因启动区具有极高的保守性,在具有不同生长速度的鸡品种间不存在任何差异。说明鸡的不同生长速度和成年体重,不是由于生长激素5′调控区变异造成的。鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或3′端侧翼序列的影响。     

蓝粒小麦花青素合成途径中的查尔酮合酶基因和类黄酮3′5′-羟化酶基因3′末端的克隆和表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从蓝粒小麦(Triticum aestivum L.×Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C. Wang)发育种子中克隆到两个查尔酮合酶基因(TaCHS.t1,TaCHS.w1),分别编码394个氨基酸,二者核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为96.0%和98.9%;而且克隆到一个类黄酮3′5′-羟化酶基因(F3′5′H)3′-末端.分别从长穗偃麦草(Thinopyrum ponticum(Podp.)Z.W.Liu et R.R.-C.Wang)、蓝粒小麦、白粒小麦和中国春基因组中分离到查尔酮合酶基因(CHS)的全长序列(ThpCHS.tg,TaCHS.bg,TaCHS.wg,TaCHS.csg),它们的核苷酸序列之间具有很高的同源性,且均含有一个内含子(intron),序列差异主要在内含子.通过DNA序列比较,发现一个CHS与亲本之一的长穗偃麦草基因组同源性达100%,一个CHS与另一白粒亲本基因组同源性达99%,表明来自于父、母本的CHS在蓝粒发育的种子中均表达.Southern杂交结果表明CHS在小麦中的拷贝数至少有4个,不同颜色的蓝粒小麦、白粒小麦间拷贝数基本一致,但都与长穗偃麦草有差异,根据以上结果初步判定CHS在蓝粒小麦中属于一个多基因家族.Reverse Northern分析表明CHS在开花后15 d发育的蓝粒小麦中具有较强的表达;花后21 d F3′5′H和DFR的转录本积累显著高于CHS,基本上检测不到CHS的表达.这三个基因在蓝粒小麦中的表达顺序与其他植物花青素合成途径中的基因表达次序一致:CHS先于F3′5′H,F3′5′H先于DFR.实验还表明F3′5′H和DFR在幼叶中表达也较强,CHS仅在发育种子中表达,具有组织特异性.花后21 d,F3′5′H在白粒、蓝粒小麦和中国春种子中均强烈表达,蓝粒小麦CHS和DFR转录本比白粒小麦多.因此,认为在蓝粒小麦中存在花青素生物合成途径,在蓝色色素形成过程中,该途径中的结构基因受到调节基因的调控.     

猪内源性反转录病毒5′端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5′端非编码区(5′UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5′UTR。通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5′UTR与GenBank公布的部分PERV 5′UTR相比较,同源性在82.6~94.8%之间。一级结构分析发现PERV 5′UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67~ 1与-97~-59区段。在5′UTR转录调控区(-428~ 507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关。     

家兔BMP7基因的克隆及其生物信息学分析

在对已知部分编码序列(CDS)进行分析的基础上, 采用RT-PCR分步扩增以及RACE方法, 对家兔BMP7基因3′和5′末端未知序列进行了克隆与生物信息学分析。测序结果综合分析表明, 所获序列共计1 654 bp, 包括家兔BMP7近全长前肽、全长成熟肽CDS及3′非翻译序列(3′UTR), 将已有的序列向5′和3′端分别延伸了395 bp和628 bp。序列对比表明, 克隆的家兔BMP7 CDS部分与人、小鼠的对应序列的同源性分别为91.89%和89.32%, 预测的氨基酸序列同源性分别为96.51%和96.01%。家兔BMP7 3′UTR长446 bp, 与人、小鼠对应序列同源性分别为57.38%和45.57%; 具有2个转录终止信号位点。推测家兔BMP7成熟蛋白有BMPs特有的7个位置固定的半胱氨酸残基和TGF-β家族指纹。家兔BMP7 3′UTR区转录终止信号的可选择性可能与基因转录后调控有关。     

鸡8个功能基因5′-侧翼区与内含子的SNP多样性比较

本研究旨在探讨鸡功能基因5′-侧翼区的单核苷酸多态性(SNP)水平。作者以白来航鸡、隐性白洛克鸡、杏花鸡、丝羽乌骨鸡、固始鸡、红色原鸡为材料,扩增了GH、DDBC1、RIKEN、RASGRP3、IGF1、THRSP、VIP及PRL共8个基因的5′-侧翼区DNA序列。扩增序列全长为8,399bp,SNP的总数为161个,平均每52bp出现一个SNP。8个功能基因5′-侧翼区核苷酸多样性的θ均值和π均值分别为0.00620±0.00110和0.00559±0.00100。比较检验表明,5′-侧翼区的SNP多样性显著低于内含子区域。5′-侧翼区是基因表达的一个重要调控区域,在分子进化和系统发生过程中承受着比内含子区域更大的选择压,其较低的SNP多样性是适应性较好的表现。Tajima检验与Fu和Li检验表明,与鸡繁殖性状显著关联的VIP基因和PRL基因很可能是人工选择或自然选择的目的基因。     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS—CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至Teasy vector。扩增片段的序列测定结果表明：所分离的4株SARS—CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游—197nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

靶向敲除β-珠蛋白基因座控制区增强子HS2对K562细胞转录组的影响

人类β-地中海贫血的发病机制与β-样珠蛋白基因异常表达息息相关。人类β-样珠蛋白基因以5′-ε-Gγ-Aγ-δ-β-3′的顺序排列于β-珠蛋白基因座,受5′LCR (locus control region)中5个超敏位点(hypersensitive site,HS)5′HS5～5′HS1和3′HS1调控。其中5′HS2是最重要的增强子,能产生增强子RNA(enhancerRNA)并调控ε-globin、γ-globin和β-globin的表达。为了进一步探究K562细胞中增强子5′HS2的功能,本研究首先通过染色质构象捕获技术在人慢性髓原白血病K562细胞中探测到5′HS2介导的染色质相互作用集中在以包含CTCF(CCCTC-bindingfactor)位点的3′HS1和5′HS5为边界的拓扑结构域中,5′HS2在三维空间上与HBE1、HBG2和HBG1启动子区域相互靠近。其次运用CRISPRDNA片段编辑技术在K562细胞系中删除了增强子5′HS2。最后通过RNA-seq和CUT&Tag (cleavage under target&tagmentation)实验...     

柑橘青霉菌CYP51B基因和上游调控区克隆及生物信息学分析

【目的】克隆柑橘青霉菌(意大利青霉菌,Penicillium italicum)CYP51的同源基因,并对基因序列进行生物信息学分析。【方法】通过PCR及染色体步移技术得到基因的完整序列及上下游调控序列。通过生物信息学手段对基因的结构进行分析:使用NNPP分析软件预测转录起始位点,并利用TFSEARCH1.3软件分析转录因子结合位点。利用SWISS-MODEL在线软件对蛋白进行同源模建。【结果】克隆得到了意大利青霉菌CYP51的同源基因,命名为Pi CYP51B。获得的Pi CYP51B及上下游调控区序列总长为3 496 bp,包括上游910 bp和下游834 bp的序列。Pi CYP51B基因的开放阅读框全长1 575 bp,编码524个氨基酸。该基因含有3个分别为74、51、52 bp的内含子,分别位于247 bp与320 bp之间,519 bp与569 bp之间,1 635 bp与1 686 bp之间。Pi CYP51B 5′上游调控区序列的总长为579 bp。生物信息学分析结果显示:转录起始位点位于上游458 bp处;上游调控区不仅包含启动子的核心结构序列TATA盒(位于-25 bp处),也包含多个转录因子结合位点,如Abd-B、ADR1、AP-4、GATA-1、Cdx A、Clox和Oct-1等。在上游调控序列中嘌呤含量高,而且从+387 bp处开始存在4个连续高嘌呤含量的热激转录因子特异性结合位点(HSF);在+106 bp处开始存在3个连续的Cdx A转录因子结合位点。选用人CYP51晶体结构(PDB ID:3LD6)为模板,利用SWISS-MODEL在线软件构建了意大利青霉菌CYP51B蛋白的结构模型。【结论】克隆了意大利青霉Pi CYP51B基因,其上游含有多个热激应答转录因子特异性结合位点(HSF)表明其参与逆境应答。该基因作为意大利青霉菌CYP51的同源基因,可能与青霉菌对真菌药物的抗药性密切相关。     

人SCF基因5′旁侧-1190～- 853 AT富集区功能研究

 已有的报告基因和EMSA实验研究表明 ,人干细胞生长因子 (SCF)基因 5′旁侧AT富集区- 1 1 90～ - 853在HeLa和MCF 7细胞中均能增强下游基因转录 ,可能为一个核基质结合区(MAR) ,对人SCF基因的转录发挥调控作用 .为进一步研究该AT富集区的功能 ,将人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区分别克隆入SV40或CMV启动子前后紧接着CAT报告基因 ,瞬时转染Jurkat,HepG2和 3T3细胞 ,检测CAT报告基因的瞬时表达活性 .结果表明 :人SCF基因 5′旁侧- 1 1 90～ - 853AT富集区在Jurkat和HepG2细胞中 ,对分别由SV40和CMV启动子引导的CAT基因表达均有抑制作用 ;但在 3T3细胞中对SV40启动子的转录活性表现出增强作用 ,对CMV启动子的转录活性无明显影响 .这些结果提示 ,人SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853AT富集区转录调控具有组织细胞特异性 ,在不同的细胞中可能发挥转录增强或抑制作用     

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 ,该负调控区可在一定程度上加速mRNA的衰变     

紫色马铃薯类黄酮3，′5′-羟化酶基因（StF3′5′H）的克隆及分析

类黄酮3′,5′羟-化酶（ flavonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H）是植物花青素生物合成途径中的一个关键酶,紫色土豆（ Solanum tueb or sum） F3′5′H基因的克隆将为花青素合成调控和花青素代谢工程研究提供优质基因资源。研究采用RACE技术克隆了紫色土豆F3′5′H基因的cDNA全长序列,用生物信息学方法对其核苷酸和蛋白质序列进行了分析,并用半定量PCR 技术分析了F3′5′H基因在不同组织中的表达情况,同时研究了赤霉素和蔗糖处理后F3′5′H基因表达与花青素积累之间的相关性。研究结果表明,克隆的紫色土豆F3′5′H的cDNA全长为1854 bp,包含一个1530 bp的完整ORF,共编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,StF3′5′H基因推测编码的氨基酸序列与其它植物的F3′5′H蛋白的相似性很高。 StF3′5′H基因的表达具有组织特异性,在紫色土豆根、茎和叶柄中都有表达,其中在叶柄中表达最强,而在块茎、叶轴和叶片中几乎检测不到StF3′5′H基因的表达。赤霉素和蔗糖能促进紫色土豆StF3′5′H基因的表达,进而促进花青素的积累。     

油菜profilin基因的克隆和表达分析

profilin是高等植物中的一种与肌动蛋白结合的蛋白,采用RT-PCR技术克隆了油菜（Brassica napus L.cv.canadian tween)花粉中的一个369bp的cDNA片段,序列分析结果表明,该cDNA与已报道的其他植物的profilin基因具有较高核酸序列同源性,与玉米（Zea maysL.)基因同源性为82%,拟南芥（Arabidopsis)基因同源性为85%,水稻（Oryza sativa L.)基因同源性为81%,烟草（Nicotiana tabacum L.)基因同源性为82%,结论5′RACE和3′RACE技术,获得了全长cDNA,其为672bp。该cDNA包含一个开放密码框。5′未翻译区和一个带有Poly(A)的3′区域。Northern杂交结果显示它主要在花粉和花药中表达。     

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 ,该负调控区可在一定程度上加速mRNA的衰变     

甘蔗 UGPase 5’侧翼序列克隆及缺失表达分析简

以甘蔗(FN95;-1702)为材料,通过接头连接PCR方法克隆该基因不同长度5′侧翼序列。将不同长度的5′侧翼序列连同UGPase基因的外显子片段定向插入到GUS基因上游,在保证其后GUS编码框不发生偏移的情况下,插入的UGPase外显子融合GUS表达成为新的报告基因。根据此策略,构建了一系列表达结构为5′ Flanking Sequence-UGPase Exon-GUS-Nos polyA的5′侧翼序列缺失表达载体,进行启动子活性分析。注射法转染烟草叶片组织检测GUS瞬时表达,分析结果表明,所克隆到的UGPase基因5′端侧翼序列不具有启动子活性。     

利用优化的5′-RACE实验定位副溶血弧菌基因的转录起始位点

目的:优化5′-cDNA末端快速扩增(5′-RACE)实验平台,用于定位副溶血弧菌(VP)基因的转录起始位点。方法:提取VP的总RNA,用rDNaseⅠ消化去除可能污染的基因组DNA;利用T4 RNA连接酶将已知序列的寡核苷酸片段连接至RNA的5′端,进而将其逆转录成cDNA;以cDNA为模板,采用巢式PCR技术扩增目的基因DNA片段,并将其直接克隆入T载体;最后通过测序比对的方法确定靶基因的转录起始位点。利用引物延伸实验进一步研究VPA1027的转录起始位点,以检验5′-RACE实验结果的可靠性。结果:5′-RACE实验结果表明,VPA1027、scrG、scrA、cpsA及VPA0198的转录起始位点分别为G(-103)、G(-70)、T(-205)、C(-129)和G(-238)(翻译起始位点为+1);引物延伸结果显示,VPA1027的转录起始位点也为G(-103)。结论:优化后的5′-RACE实验可以精确定位VP基因的转录起始位点。     

荔枝LcVSP1基因5′调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome Walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质Lc VSP1基因的5′调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,Lc VSP1基因的5′调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明Lc VSP1的5′调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.