人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( + 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 ,在     

人干细胞因子基因5′旁侧序列的克隆和功能研究

人干细胞因子 ( human stem cell factor,h SCF)在多种哺乳动物干细胞的增殖、分化和移居中发挥重要作用 .利用改进的 PCR体系 ,从人类基因组 DNA中扩增出自 h SCF基因编码起始位点( 1 81 )至 5′旁侧 - 1 1 90位点共 1 372 bp的片段 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,经序列分析证明无误 .为探寻此片段中对转录调控起作用的具体区域 ,用基因缺失技术从 - 1 62 ( Bst X )位点向上游分别延伸至 - 2 73( Pst )、- 339( Sma )、- 381 ( Sac )、- 44 0 ( Eco R )、- 570 ( H inc )、-853( Bgl )及 - 1 1 90 ( Xho )等位点 ,共获 7个不同长度的 h SCF基因 5′旁侧序列片段 ,随后将这7个片段分别克隆入荧光素酶 ( luc)报告基因载体 p GL2 - Promoter.经阳离子脂质体包埋技术介导转染 He La细胞 ,培养 48h后检测 Luc活性 .结果表明 :h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域对luc表达有明显的增强作用 ,而 - 339～ - 2 73区域则显示有抑制作用 .分别以包含这两个区域的片段为探针进行竞争性凝胶阻滞实验 ,结果均出现一个或多个特异性滞留区带 ,说明这两个区域存在转录因子的结合位点 .实验结果表明 ,h SCF基因 5′旁侧 - 1 1 90～ - 853区域富含 AT,是一典型基质结合区 ,而 - 339～ - 2 73区域为一新的沉默子 ,在     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体（FXR）基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,－1　651～+200、－1　496～+200区域的启动子活性无明显区别,－847～+200区域的启动子活性最高,－544～+200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在－847～－544范围内.     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体(FXR)基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,-1651~ 200、-1496~ 200区域的启动子活性无明显区别,-847~ 200区域的启动子活性最高,-544~ 200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在-847~-544范围内.     

小鼠白蛋白启动子的组织特异性功能研究

以绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,通过对比小鼠白蛋白启动子在不同来源细胞系中启动HGFP基因的转录活性,对小鼠白蛋白启动子的组织特异性进行了研究。结果发现,小鼠白蛋白启动子在小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6和人肝癌细胞系：HepG2均有很强的转录起始功能,荧光显微镜下可以观察到IGFP表达。Hepa 1—6细胞在转染早期的48h内,CMV的启动子和增强子序列是小鼠白蛋白启动子转录活性的4倍。G418加压筛选2周后,CMV的启动子的转录活性下降到只有小鼠白蛋白启动子活性的1／2。转染人肝癌细胞系HepG2 2周后,荧光显微镜下可以观察到GFP表达。其他的细胞如中华仓鼠卵巢细胞系CHO和人肺癌细胞系PLA 801中转染的小鼠白蛋白启动子不能启动GFP的表达,而对照CMV启动子控制下的GFP基因可在CHO和PLA 801中表达。以上结果说明,小鼠白蛋白启动子仅在肝脏来源的细胞中可以起始下游基因的转录,在其他组织来源的细胞中不能起始转录,这表明小鼠白蛋白启动子具有肝脏组织特异的转录活性,但没有种属特异性。     

香蕉果实特异性ACC合酶基因启动子区的克隆及其功能初探

根据本实验室所获得的香蕉果实特异性ACC合酶cDNA序列,以改进的接头连接PCR方法通过两次步行从香蕉基因组中分别扩增并克隆了其基因5′旁侧区近端1.2kb和远端1.6kb的片段。通过拼接,构建出含有2505bp启动子区和转录起始位点下游86bp的共2591bp的基因5′旁侧区片段;其启发性动子区中34至28为推测的TATA盒序列,158至146为推测的CCAAT盒,与其它植物基因启动子结构相类似。将2.5kb启动子片段与β-葡糖苷酸酶(GUS)基因编码序列融合,用基因枪法将构建的嵌合基因转入香蕉叶、根和果实的细胞后,只在果实细胞中观察到报告基因的瞬时表达,从功能上证明了此25kb的启动子片段具有指导报告基因在香蕉果实中特异性表达的作用。同时构建5个含不同5′端缺失启动子与GUS融合基因的表达载体。瞬时表达结果表明可能负责果实特异性表达的调控区存在于转录起始位点至-1111的启动子区中,而在-1111至-608区间可能存在一个正控制区。     

人神经母细胞瘤株中β-淀粉样前体蛋白基因IL-1反应元件的研究

细胞团子IL-1β可以诱导SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中APP基因的转录．为了研究APP基因启动子区的IL-1β反应元件,用含不同长度APP启动子片段的报告基因载体,瞬时转染SH-SY5Y细胞,发现APP启动子在SH-SY5Y细胞中有较强活性,其中-488到-303区为IL-1β诱导APP转录活性增加所必需,这个区域包括1个AP1结合位点和1个HSE元件．     

人PNRC基因启动子的初步鉴定

 PNRC (praline-rich nuclear receptor coactivator) 是最近发现的一种新的核受体辅活化子,它是以牛类固醇生成因子-1(SF1)作诱饵,利用酵母双杂系统从人乳腺cDNA表达文库中筛选得到的.为了研究人PNRC基因的表达调控机制,在对人PNRC基因的生物信息分析的基础上,采用5′RACE法确定了PNRC基因的转录起始位点,克隆了人PNRC基因的5′侧翼区,并对该区进行功能分析.分别构建了11种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒,将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果发现,PNRC的5′侧翼区的-323～+27、-323～+57-123～+57、-123～+27区域的启动子活性显著升高,其中-323～+27区域的启动子活性最高.研究表明,人PNRC基因启动子的最小区域位于PNRC的5′侧翼区的-123～+27区域. .     

鸡乙酰胆碱受体γ亚基基因5′连接区含多元顺式调节元件

本工作利用瞬时表达研究了鸡Ach Rγ亚基基因5′连接区的调控机能。CAT分析表明,γ基因5′连接区-509/-302和-324/+36序列均可独立激活SV40启动子的转录,这种激活作用具有组织特异性,与方向、距离无关,符合增强子样作用。     

人p53启动子萤光素酶报告基因的构建及其活性测定

目的：克隆p53基因的启动子,插入萤光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法：采用PCR技术从人肝癌细胞系HepG2基因组中扩增人p53启动子,插入萤光素酶报告基因载体pGL4．0-empty,将重组质粒转染293T、ZR75-1、HepG2、A549细胞,测定p53启动子的转录活性。结果：构建了p53启动子的萤光素酶报告基因;通过测序及质粒酶切鉴定,所构建的p53启动子正确;活性实验表明,报告基因在多种细胞中显示构建的p53启动子活性,并呈现一定的剂量效应;转录因子USF能以剂量效应方式提高p53报告基因的转录活性。结论：克隆了人p53启动子,为进一步研究调控p53的转录因子奠定了基础。     

Limitation in use of heterologous reporter genes for gene promoter analysis. Silencer activity associated with the cloramphenicol acetyltransferase reporter gene

Various heterologous reporter genes have been widely used for the functional characterization of gene promoters. Many such studies often found weak to very strong silencer activities to be associated with specific parts of the basal promoter or further upstream regions. In this study, we carried out a systematic study on human blood coagulation factor IX (hFIX) and anti-coagulant protein C (hPC) genes, previously shown to have silencer activities associated with their 5'-flanking regions containing promoter sequences. With newly constructed chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vectors carrying hFIX or hPC gene promoter sequences, we confirmed the strong silencer activities associated with the regions nt -1895 through nt -416 of the hFIX gene or with the region nt -802 through nt -82 of the hPC gene. However, no such silencer activities associated with the specific regions were found when autologous hFIX cDNA, hFIX minigenes, or hPC minigenes were used as reporters in the expression vector system. Relative levels of CAT, hFIX, and hPC proteins produced in the transient assays correlated well with their mRNA levels. Human FIX minigene constructs containing a simian virus 40 (SV40) 3'-untranslated region (UTR) taken from the CAT reporter gene showed no silencer activity, indicating that SV40 3'-UTR sequence of the CAT reporter gene does not contribute to the silencer activity. Expression vectors constructed with the beta-galactosidase gene under the control of hFIX gene promoter sequences also showed no silencer activity associated with the region nt -1895 through nt -416. These findings indicate that silencer activities associated with specific regions of promoter sequences as analyzed with CAT reporter genes may represent artifacts specific to the CAT reporter genes. Our findings strongly suggest a need for re-examination of promoter characterizations of many eukaryotic genes, which have been studied to date with CAT reporter genes.     

人皮肤成纤维细胞中α1(Ⅰ)前胶原基因转录调控研究

为寻找纤维化形成中调控人Ⅰ型前胶原基因高水平转录的启动序列及其DNA结合蛋白 ,以人皮肤成纤维细胞α1(Ⅰ )前胶原基因转录起始点上游 - 2 5kb至 + 4 2bp的片段为靶序列 ,采用PCR、基因重组、报告基因测活、细胞基因转染技术比较不同长短启动子活性 .凝胶滞留实验 (EM SA)研究高启动活性片段相应的DNA结合蛋白 .基因转染高活性转录因子识别序列至靶细胞 ,探讨前胶原基因激活阻断的新手段 .结果表明 ,- 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp序列具有强启动调控活性 ,而 - 10 5～ + 4 2bp片段启动活性最低 .EMSA对高启动活性小片段DNA结合蛋白的分析提示 ,- 2 6 8～ + 4 2bp序列中存在转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1的特异结合位点 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1至靶细胞可竞争性阻断胶原基因启动转录激活 .研究提示 ,人α1(Ⅰ )前胶原基因 - 2 4 83～ + 4 2bp、 - 2 6 8～ + 4 2bp片段有高启动活性 .转录因子Ap 1、Sp 1、NF 1与 - 2 6 8～ + 4 2bp序列中相应识别序列的结合与其基础高转录活性有关 .转染高活性转录因子识别序列Ap 1、Sp 1可从转录水平阻断胶原基因的激活