4株SARS冠状病毒基因组5’端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector。扩增片段的序列测定结果表明:所分离的4株SARS-CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5'RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5'端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector.扩增片段的序列测定结果表明所分离的4株SARS-CoV基因组5'端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大.同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5'-CUAAAC-3'.     

严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的鉴定与分析

利用293细胞对SARS病人样品进行病毒扩增,培养上清中病毒颗粒经过纯化后,利用蛋白质组学技术,对纯化得到的SARS冠状病毒颗粒蛋白进行初步分离与鉴定。其中质谱分析结果最终表明,分子量约150kD的蛋白质的氨基酸序列与SARS—CoV基因组所预测S蛋白质序列高度吻合,从而首次从蛋白质水平对SARS冠状病毒S蛋白的氨基酸序列进行了证实。     

在传染性非典型肺炎患者组织和血液中发现冠状病毒

用RT-PCR从广东两例传染性非典型肺炎(非典型肺炎)死亡病例的肺和脾标本中,以及北京、辽宁和宁夏非典型肺炎患者血清中,扩增出冠状病毒核苷酸序列。这些PCR产物为冠状病毒RNA聚合酶基因部分片段,所有测定的序列和国内外SARS病毒序列相同。这些发现提示,冠状病毒和非典型肺炎关系密切,有助于确定我国非典型肺炎的病因。所建立的套式PCR方法可以用于检测临床标本。由于血液中存在SARS病毒,进行血清操作时需要注意安全保护。     

4株SARS冠状病毒中国分离株3′非编码区的序列测定及分析

分别对 4株SARS冠状病毒中国株基因组 3′非编码区序列进行测定和分析 ,然后应用Blast、DNAstarGeneQuest等软件对中国株的这段序列与其它SARS和非SARS冠状病毒的序列进行比较 .结果显示 ,所测 4株SARS冠状病毒中国分离株的 3′非编码区长度均为 339nt,与其它已测序SARS冠状病毒的相应序列完全一致 .SARS冠状病毒的非编码区含有冠状病毒保守的“伪结”结构 .在距末端 138nt处还存在 1个长约 32nt的Ⅱ型茎 环结构的序列 ,该序列在其它已知人冠状病毒中并不存在 ,而与禽传染性支气管炎病毒和星状病毒中的对应序列高度同源 .     

一步法双重RT—PCR检测SARS冠状病毒技术研究

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法。利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉澈液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s／as引物出现预期产物。同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段。在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性。     

一步法双重RT-PCR检测SARS冠状病毒技术研究

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法.利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉漱液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s/as引物出现预期产物.同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段.在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性.     

SARS冠状病毒基础研究进展

SARS(severe acute respiratory syndrome,严重急性呼吸综合症)是严重危害人类健康的传染病,现已发现其病原体为正链RNA冠状病毒(coronavirus,CoV),SARS CoV为一类新型的冠状病毒,至今没有有效对抗其感染的药物。本文从SARS CoV的功能受体、蛋白酶、疫苗和RNA干扰技术在SARS CoV研究中的应用等方面综述了其基础研究进展,旨在为抗SARS CoV的药物研制提供一定的理论依据。     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514 bp.与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97.2%～98.0%和96.8%～97.1%,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致.但HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长.另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95.0%～95.7%和93.9%～94.4%.CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8 nt的片段.5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异.这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系.此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能.本文还讨论了RSV的分子流行病学.     

SARS冠状病毒的起源研究进展*

SARS冠状病毒(SARS—CoV)是一种新现病毒,可感染多种动物,果子狸是人类SARS—CoV重要的动物宿主之一,是已知较理想的实验动物模型。遗传因素在SARS-CoV的出现过程中起重要作用,它很可能是哺乳动物和鸟类冠状病毒之间重组产生的新物种,但发生基因重组不是SARS在人群中暴发的原因。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株基因组序列测定和分析

应用RT-PCR方法分段扩增出PRRSV上海分离株S1毒株的4条基因大片段,扩增后的产物分别克隆于pCR-XL-TOPO载体鉴定后测序,同时应用RACE方法对S1毒株的3′和5′基因末端进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序,按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSVS1株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSVS1株基因组全长15441bp,包含9个开放式阅读框,5′UTR含有189nt,3′端UTR含有181nt,其中包含30ntPoly(A)。基因组序列分析结果显示该病毒与ATCCVR-2332和BJ-4分离株的核苷酸同源性分别99.5%和99.6%。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8%。     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514bp。与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97．2％～98．0％和96．8％～97．1％,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致。但：HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长。另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95．0％～95．7％和93．9％～94．4％。CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8nt的片段。5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异。这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系。此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能。本文还讨论了RSV的分子流行病学。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

PCR条件对扩增SARS-CoV多聚酶部分基因的影响

目的：对该实验室已建立的检测SARS冠状病毒多聚酶基因的套式RT-PCR方法进行优化。方法：从SAPS病人的嗽口水标本中提取RNA,调整套式PCR的退火温度,扩增SARS冠状病毒多聚酶部分基因。扩增出的阳性片段连接入pGEM-T载体中,测序后比较其与已知SARS冠状病毒的同源性。结果：通过改变PCR条件,成功从一SARS病人的嗽口水中扩增出SARS冠状病毒多聚酶部分基因。结论：针对不同标本优化PCR反应条件非常重要。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列的分析

用重组DNA技术及序列分析法测定了南方菜豆花叶病毒RNA基因组3′端1,000个碱基的序列,以及由此序列推导出的整个外壳蛋白的氨基酸顺序,它与巳报导的基本上一致。介绍了用DNA的寡核苷酸水解混合物作为起始引物,以3′端不含PolyA尾巴且不能加上PolyA的病毒RNA作为模板合成互补DNA,及进一步无性繁殖此cDNA的方法。     

小西葫芦黄化花叶病毒分离物的3′末端序列多态性研究

研究了来自中国大陆9个小西葫芦黄化花叶病毒（ZYMV）分离物的基因组3′末端核苷酸序列及所推导的外壳蛋白（CP）氨基酸序列以及3′末端非编码区（UTR）序列,并与其它地区所报道的16个ZMYV分离物进行了同源性比较。ZYMV CP基因核苷酸序列具有一定的寄主相关性和地域相关性,但总体上其关联程度不明显;同时,CP氨基酸序列的寄主适应性程度明显高于地域相关性。25个ZYMV分离物的CP氨基酸序列根据其变异程度分为2个区： N端约41个氨基酸为高度变异区,CP核心区和C端氨基酸序列为保守区。研究结果初步揭示了ZYMV作为单链RNA病毒通过与寄主相互作用而表现寄主适应性变异的趋势。     

菜粉蝶微孢子虫核糖体RNA(rRNA)编码基因的研究

用PCR方法扩增、克隆了菜粉蝶微孢子虫核糖体小亚单位RNA(SSUrRNA)编码基因的核心序列 1 2 0 5bp后 ,进一步克隆到菜粉蝶微孢子虫SSUrRNA基因 3′端至LSUrRNA基因 5′端 (580R区 ) 657bp长的序列。与GenBank中对应序列比较后 ,在 657bp这段序列鉴定出菜粉蝶微孢子虫SSUrRNA基因 3′末端、rRNA基因内转录间隔区 (ITS)及LSUrRNA基因 5′端 (580R区 ) ,它们分别位于该序列中 1 45位、1 46 1 86位及 1 87位。与SSUrRNA基因核心序列拼接后SSUrRNA全基因长为 1 2 4 5bp ,rRNA基因内转录间隔区为 41bp及核糖体大亚单位RNA(LSUr RNA)编码基因 580R区为 470bp。同时还构建了菜粉蝶微孢子虫SSUrRNA的完整二级结构。关于微孢子虫rRNA基因的克隆及SSUrRNA的二级结构在国内尚属首次报道 ,它为进一步利用核糖体RNA编码基因及SSUrRNA的二级结构对不同微孢子虫的分类及亲缘关系的确定奠定了基础     

广东地区SARS-COV细胞培养模型的建立和初步应用

目的：建立中国广东地区SARS—CoV细胞培养模型。方法：通过将SARS—CoV广东地区分离株GD322在Vero E6细胞中连续传代,检测TCID50,获得稳定的细胞模型。利用此细胞培养模型,对不同温度、紫外线等条件下SARS-CoV的存活时间进行了比较。对重组人复合干扰素α抗病毒效果进行了筛查。结果与结论：SARS—CoV对外界环境抵抗力比普通冠状病毒强,对重组人复合干扰素α有较高的敏感性,抑制指数达4．9。     

检测博尔纳病病毒RNA的RACE技术的建立

目的建立检测博尔纳病病毒(BDV)RNA的3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)方法。方法根据已知的BDV p40基因序列设计上游引物sp1;提取BDV(H1766株)持续感染OL细胞的总RNA,用引物sp1和oligo dT进行3′RACE扩增,将PCR产物克隆到pGEM-T载体并转化到大肠埃希菌中,制备阳性菌落的目的质粒,进行序列测定和同源性比对;同时对检测BDV RNA的3′RACE方法的特异性和敏感性进行分析。结果建立了检测BDV RNA的3′RACE技术;所获得的BDV p40基因的3′末端扩增产物的核苷酸序列与已知BDV(H1766株)p40基因的核苷酸序列同源性为100%;本方法对BDV RNA(mRNA)具有特异性,但对BDV p40基因重组质粒无扩增结果;并且可以检测到0.04 ng以上含量的BDV感染细胞的总RNA。结论检测BDV RNA的3′RACE技术可以排除实验室污染造成的BDV基因扩增的假阳性,并可用于进一步分析BDV基因序列的特点以及评价BDV相关基因的表达情况。     

抗SARS药物设计的靶点--冠状病毒主蛋白酶

严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)由SARS冠状病毒(SARS—CoV)感染所引起。SARS—CoV主蛋白酶(M^pro)在冠状病毒复制及转录过程中起重要作用，因而成为直接抗SARS病毒药物设计的一个颇为诱人的靶标。SARS—CoVM^pro的三维结构的阐明、酶与抑制剂间结合方式的确认，为发现直接作用于M^pro的抗SARS药物设计提供了基础。