基因芯片技术检测重要人兽共患病病毒方法的建立

为了建立能对25种重要人兽共患病病毒进行筛查及鉴定用的基因芯片技术,本实验首先设计针对每种病毒的寡核苷酸探针并进行探针特异性的生物信息学验证.然后探索病毒核酸随机扩增方法,优化杂交动力学条件,建立本芯片标准的数据处理分析方法.最后用细胞培养的病毒和模拟临床标本验证芯片的敏感性与特异性．结果表明,锚定随机PCR扩增法适合于本芯片病毒核酸的扩增;芯片杂交前用0.25% NaBH4进行封闭,最优杂交条件为51 ℃,2 h及50%甲酰胺浓度;芯片具有较好的敏感性及检测特异性．初步结果表明,本实验所建立的基因芯片技术可应用于对25种重要人兽共患病病毒进行筛查及鉴定．     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS—CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至Teasy vector。扩增片段的序列测定结果表明：所分离的4株SARS—CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游—197nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

黄热病毒的一步RT-PCR法检测

自不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液中制备总RNA,在自制缓冲液条件下,进行一步RT-PCR法检测。对一步RT-PCR法与常规RT-PCR的敏感性进行比较,并且以基孔肯亚病毒和登革1-4型病毒RNA为模板进行特异性观察。结果表明,本研究建立的一步RT-PCR法可检出2.8×10~3PFU的病毒,敏感性比常规RT-PCR法高10倍,且与基孔肯亚病毒、登革病毒1-4型无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性,适用于黄热病毒的病原学检测。     

森林脑炎研究进展

森林脑炎又名蜱传脑炎(TBE),是由森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)引起,经蜱传播,以中枢神经病变为特征的急性传染病.1910年,在前苏联亚洲部分发现以中枢神经病变为主要特征的急性传染病.1936年,Tkachev氏首次用小白鼠从患者分离到病毒.1937年从当地主要蜱种全沟硬蜱体内分离到同一种病毒,提出并证实蜱为本病传播媒介.1938年证实了森林中的啮齿类动物为本病贮存宿主.第二次世界大战后,欧洲有关本病的报告越来越多,几乎大部分国家均有报告.1990年由Pletnev AG等人首次完成森林脑炎病毒全基因组序列测定.我国于1942年发现该病,1952年从患者及蜱中分离到森林脑炎病毒,近几年流行又有增强趋势[1].     

茶毛虫核型多角体病毒(EpNPV)多角体蛋白基因的定位及克隆

茶毛虫核型多角体病毒(Euproctis pseudoconspersa Nuclear Polyhedrosis Virus简称EpMPV),属于杆状病毒科核型多角体病毒属,能使茶毛虫染病死亡.EpNPV据报道最初由日本学者于1957年发现[1],随后在其它国家和地区也有相关报道[2];我国在贵州、湖北、广西和云南等地也有发现,并在EpNPV病毒杀虫剂的大田应用方面做了大量的工作,取得了一定的社会、经济和生态效益[3].     

我国森林脑炎病毒森张株编码区序列测定

为鉴定我国森林脑炎病毒亚型,了解基因组结构与生物功能的关系,同时为森林脑炎病毒新型疫苗研制打下基础,对森林脑炎病毒森张株编码区序列进行测定.根据已发表的Sofjin-HO、Oshima5-10株序列设计9对重叠引物,通过RT-PCR扩增不同的cDNA片段,分别克隆至pGEM(R)-T载体,转化DH5 α菌,挑阳性克隆PCR、酶切鉴定后测序.结果表明森张株编码区全长10 245nt,编码3 414个氨基酸.我国森林脑炎病毒森张株与Oshima5.10、Sofjin-HO、Sofjin同源性最近,属于远东亚型.     

单克隆抗体夹心ELISA检测SARS病毒抗原的研究

目的:建立单克隆抗体(McAb)夹心ELISA法,用于检测SARS病毒(SARS-CoV)抗原。方法:用间接夹心ELISA法筛选捕捉和标记用单克隆抗体的组合,采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP),优化后用于检测SARS-CoV。结果:从12株抗SARS-CoV鼠单克隆抗体中筛选出2A3/1C5组合用于捕捉SARS-CoV,1A5/1B4组合标记HRP作为指示抗体。优化后2A3/1C5的最适工作浓度为1∶4000,HRP-1A5/1B4的最适工作浓度为1∶2000。本方法检测SARS-CoV的敏感度为105pfu/mL。结论:单克隆抗体夹心ELISA法可特异性检测SARS-CoV抗原。     

4株SARS冠状病毒基因组5’端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector。扩增片段的序列测定结果表明:所分离的4株SARS-CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列与生物特性的关系,从而为疫苗研制打下基础,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT-PCR扩增,克隆法测序。结果表明：森张株5′-UTR长129nt,与Sofjin-HO、Oshima5-10、Vasilchenko、Neudoerfl、263、Hypr的同源性分别为92％、91％、89％、87％、87％、87％。森张株存在三处特异性变异C18→T、T30→C及49、50连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似5′端非编码区序列测定方法;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录、翻译及核衣壳的形成。     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5'RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5'端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector.扩增片段的序列测定结果表明所分离的4株SARS-CoV基因组5'端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大.同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5'-CUAAAC-3'.