抑制Dicer基因对shRNA功能发挥的影响

本文将Dicer基因的RNA酶Ⅲ结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2 A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2 A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平.结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达.结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与.     

RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株;构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6 1,构建shRNA表达载体pSHGFP,转染HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测mRNA水平。结果利用PCR方法从HepG2.GFP细胞基因组DNA中检测到GFP基因;pSHGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pSHGFP能够显著抑制内源性GFP的表达,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。     

不同细胞系中RNA干扰抑制血管内皮生长因子表达

目的通过RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并观察在不同细胞系中,RNA干扰作用强度的变化。方法将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR观察VEGF表达受抑的程度及在不同细胞系中RNA干扰作用强度的变化。结果成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,发现其在HEK293和HT29细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率分别为72%和42%;但在Hela细胞中,抑制作用明显减低至28%;在HepG2细胞中抑制作用更弱,仅为13%。结论针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度有明显差别,提示RNA干扰作用存在明显的细胞系选择性。     

RNA干扰抑制麻疹病毒体外复制的实验研究

为了研究短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰对麻疹病毒体外复制的抑制作用,构建靶向与麻疹病毒复制密切相关的宿主细胞基因Rab9 GTPase基因特异性shRNA表达载体,分别转染Vero-E6和B95a细胞后感染麻疹病毒Edmonston株和野生株。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)检测转染细胞内Rab9 GTPase基因表达水平;标准蚀斑试验测定麻疹病毒滴度。结果显示转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平同对照组相比明显降低,标准蚀斑试验显示麻疹病毒的复制受到显著抑制,抑制率达到90%以上。结果表明载体介导的shRNAs能通过特异性下调Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒体外复制,Rab9 GTPase可能成为治疗麻疹病毒感染的RNA干扰靶。     

RNA干扰抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的 应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法 将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体,再转染人结肠癌细胞HT29,通过RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,观察VEGF表达受抑的程度。结果 成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR、Northern杂交、免疫荧光和Western杂交,均发现其能明显抑制HT29细胞VEGF基因的表达,抑制率分别达42%、88%、73%和82%。结论 针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞VEGF基因的表达。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选

构建编码人钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1 mRNA的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体shRNA-ATP1A1(ATP1A11、ATP1A12和ATP1A13),并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.设计、合成靶向ATP1A1的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建3个shRNA表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPase α1表达变化;MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13对HepG2增殖活性和细胞周期的影响.构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,测序符合设计要求,构建成功.ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPase α1 mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显(P<0.05).ATP1A13可抑制HepG2细胞的增殖;转染48和60 h,HepG2细胞细胞周期呈现S期阻滞;实时定量PCR检测ATP1A13敲低HepG2Na+/K+-ATPase α1mRNA呈时间依赖性,72 h后表达降低约90%.试验成功构建靶向钠钾ATP酶α1亚单位的shRNA质粒表达载体,其中shRNA-ATP1A13可显著抑制HepG2细胞增殖引起细胞周期S期阻滞.     

针对核因子-kB P65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的:构建针对人核因子kB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制NF-kB P65基因表达的作用.方法:根据shRNA设计原则,在人NF-kB P65全长序列中选取合19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER.retro.neo中,构建针对NF-kB P65基因的shRNA表达载体.经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞.分别采用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果.结果:限制性酶切和基因测序证实针对人NF-kB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF-kB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制.结论:成功构建了NF-kB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF-kB P65的表达.     

SUSD2基因干扰表达载体的构建及在A549细胞中鉴定北大核心

[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染A549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制A549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在A549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

抑制人cFLIP 基因表达的shRNA 质粒的构建与功能验证

目的:构建特异性抑制cFLIP基因表达的质粒并检测其对肝癌细胞的影响。方法:根据人cFLIP mRNA的序列,设计合成3对cFLIP基因的shRNA,将其连入干扰载体,转染HepG2,蛋白印迹法检测基因表达情况,以检测其对肝癌细胞的影响。结果:构建了特异性抑制肝癌细胞中cFLIP表达的质粒。结论:成功构建能特异且高效阻断cFLIP表达的shRNA表达质粒,为进一步研究cFLIP基因对肝癌增殖的影响及其临床应用奠定了基础。     

An efficient method to enhance gene silencing by using precursor microRNA designed small hairpin RNAs

Gene silencing can be mediated by small interfering RNA (siRNA) and microRNA (miRNA). To investigate the potential application of using a precursor microRNA (pre-miRNA) backbone for gene silencing, we studied the inhibition efficiency of exogenous GFP and endogenous GAPDH by conventional shRNA- and pre-miRNA-designed hairpins, respectively. In this study, the conventional shRNA-, pre-miRNA-30-, and pre-miRNA-155-designed hairpins targeting either GFP or GAPDH were transfected into the HEK293 cells that were mediated by the pSilencer-4.1-neo vector, which carries a modified RNA polymerase II-type CMV promoter. Comparisons with conventional GFP shRNA showed that GFP levels were reduced markedly by pre-miRNA-30- and pre-miRNA-155-designed GFP shRNAs by fluorescence microscopy. The consistent results from semi-quantitative RT-PCR and Western blot analysis revealed that pre-miRNA-30- and pre-miRNA-155-designed GFP shRNAs could suppress GFP expression significantly. As for endogenous GAPDH, the results from semi-quantitative RT-PCR and Western blot analysis showed that pre-miRNA-30- and pre-miRNA-155-designed GAPDH shRNAs could suppress GAPDH expression even more efficiently than conventional GAPDH shRNA. Together, this study confirmed the efficiency of gene silencing mediated by pre-miRNA-30- and pre-miRNA-155-designed shRNAs, demonstrating that pre-miRNA-designed hairpins are a good strategy for gene silencing.     

核受体相关因子1表达下调对多巴胺能细胞酪氨酸羟化酶和神经突起生长的影响

将合成的核受体相关因子1（nuclear receptor-related factor 1,Nurr1）特异性短发夹寡核苷酸（small-hairpin RNA,shRNA）序列插入真核表达载体pSilen Circle（pSC）,构建Nurr1基因特异性shRNA真核表达载体,转染体外培养多巴胺能神经前体细胞系MN9D,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测其对MN9D细胞内源Nurr1的干扰作用及其对酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）表达的影响,并在倒置显微镜下观察MN9D细胞神经突起生长的情况,探讨Nurr1 shRNA表达载体对多巴胺能细胞表型标记物删和以神经突起延长为特征的细胞成熟的影响。结果表明,脂质体组细胞和转染阴性对照质粒的MN9D细胞内Nurr1、TH的表达正常,而转染Nurr1 shRNA真核表达载体（pSC-N1和pSC-N2）的MN9D细胞内Nurr1和TH的mRNA水平明显降低,Nurr1 mRNA的下降率分别为62．3％和45．6％,TH mRNA的下降率分别为76.3％和62．6％。同时Nurr1和TH蛋白的表达亦明显下调,Nurr1蛋白的下降率分别为57．4％和72．0％,TH蛋白的下降率分别为79．1％和70．1％。另外,转染Nurr1 shRNA真核表达质粒的MN9D细胞神经突起延长有所减少,但是与正常细胞无明显差异。结果提示：Nurr1 shRNA真核表达载体能显著下调MN9D细胞内源Nurr1和TH mRNA和蛋白的表达,同时可能对MN9D细胞的神经突起延长有一定的抑制作用。Nurr1 shRNA表达载体的成功构建为多巴胺能神经元发育以及帕金森病相关基因的功能研究奠定了基础。     

A quick and efficient approach for gene silencing by using triple putative microRNA-based short hairpin RNAs

The RNA interference (RNAi) technique has been widely used in gene function studies. It is typical to screen for effective siRNAs by knocking down targeted genes since a single gene can be suppressed by several siRNAs to varying degrees. The miRNA-based short hairpin RNA (shRNA) is a natural inducer of RNAi and has been used in siRNA expression strategies. We investigated the potential application of multiple putative microRNA-based shRNAs for gene silencing and studied the inhibition efficiency of exogenous GFP and firefly luciferase (luc) by triple human mir155-based shRNA expression vectors. A total of three candidate siRNA sequences targeted against GFP or luc were selected based on an online prediction program. Single and triple miRNA-155-based shRNAs targeted against GFP or luc were transfected into HEK293 cells mediated by the pcDNA₃ vector with an RNA polymerase II-type CMV (cytomegalovirus) promoter. Comparisons with negative control shRNAs revealed that GFP levels were markedly reduced by the triple miRNA-155-based GFP shRNA by fluorescent microscopy. Consistent results from the dual luciferase assay and real-time quantitative RT-PCR revealed that the triple miRNA-155-based GFP shRNA significantly suppressed GFP expression (P < 0.01), without significant differences from the most effective single miRNA-155-based GFP shRNA (P > 0.05). Results from the dual luciferase assay and real-time quantitative RT-PCR revealed that the triple miRNA-155-based luc shRNA significantly suppressed luc expression as the most effective single miRNA-155-based luc shRNA (P < 0.05). These studies demonstrated the gene silencing efficiency mediated by the triple putative miRNA-155-based shRNAs. This suggested that multiple miRNA-based shRNAs are quick and valuable strategies for gene silencing.     

HSP27 特异性shRNA 表达载体的构建及在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株 SW1990/Gem 中的表达

目的:构建HSP27基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体及观察其在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达,为进一步探索肿瘤的基因治疗打下前期基础。方法:参考文献及shRNA设计原则,设计并合成2条能转录shRNA的DNA序列,退火连接后,插入含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNAT-shHSP27。重组载体经鉴定后转染SW1990/Gem,倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-PCR、Western Blot从mRNA及蛋白水平探讨转染对耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem的影响。结果:成功构建了针对HSP27基因的shRNA表达载体。倒置荧光显微镜下显示转染48h后SW1990/Gem细胞内存在GFP表达。RT-PCR、WesternBlot结果提示转染后HSP27的mRNA及蛋白表达水平较对照组有明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建针对HSP27基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制HSP27表达,为进一步研究HSP27与胰腺癌生物学行为及化疗耐药等相关性奠定了基础。     

大鼠Pael -R基因shRNA干扰载体的构建及功能筛选鉴定

目的:构建并筛选针对大鼠Pael -R基因的有效shRNA干扰载体并鉴定其干扰效果.方法:构建三个针对大鼠Pael-R基因的shRNA表达载体,利用脂质体转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,以G418筛选抗性细胞克隆并利用RT-PCR和Western Blotting鉴定Pael -R基因的表达.结果:在构建的3个干扰载体中,转染pRNA-U6/PaelR -3的细胞克隆中Pael -R表达在mRNA水平为29％,与对照组相比下降了45.3％,在蛋白质水平为32％,下降了27.3％ (P＜0.05).结论:构建了Pael -R基因的有效干扰载体pRNA-U6/PaelR -3,并得到了Pael -R基因表达下调型PC12细胞克隆,为研究Pael -R基因表达下调在帕金森病的发病机制及其治疗中的作用奠定了基础.     

siRNA沉默socs3对红系发育的影响

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western-blot结果显示,SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制.进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化.结果发现,SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高.研究结果证明,SOCS-3在造血发育中有重要调控作用,而对其表达进行干涉或沉默将在规模化的红细胞诱导研究中发挥重要作用.