重庆地区成人感染性腹泻病原学分析

目的 研究重庆地区成人感染性腹泻患者的病原学特点.方法 采用MICROSCAN系统进行粪便细菌培养,用ELISA和多重PCR方法进行病毒检测.结果 130例腹泻标本中,检出细菌阳性17例,包括沙门菌属7例,志贺菌属5例,副溶血弧菌3例和嗜水气单胞菌2例.病毒检测中,单重感染30例,双重感染10例,三重感染1例.A组轮状病毒检出率为3.85％ (5/130),B轮状病毒检出率为3.85％ (5/130),C组轮状病毒检出率为15.4％ (20/130),诺如病毒检出率为9.23％ (12/130),星状病毒检出率为4.62％(6/130),札如病毒检出率为3.08％ (4/130),腺病毒检出率为0.77％(1/130).结论 重庆地区成人腹泻患者中,沙门菌和志贺菌为细菌感染的主要菌种,轮状病毒和诺如病毒为病毒感染的主要病原体.     

丙型肝炎病毒5’非翻译区不同结构域对其启动子活性的影响

在前期工作已证实HCV基因组5’UTRDNA序列具有启动子活性的基础上,分别构建5’UTR不同结构域的DNA序列驱动虫荧光素酶基因表达的质粒pGL3-5’UTR,转染HepG2细胞以及用全长的5’UTRcDNA构建质粒分别转染HepG2、Hela、HEK293、L02细胞,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶的表达水平,逆转录聚合酶链反应检测虫荧光素酶基因mRNA水平,并与相应对照作比较。结果显示当四个结构域都具备时,荧光素酶相对活性为5.91±0.65,为SV40启动子的18.7%;失去结构域I以后,荧光素酶相对活性为9.52±0.32;失去结构域I和II以后,荧光素酶相对活性为2.64±0.25;失去结构域III和IV以后,荧光素酶相对活性为0.32±0.09;失去结构域IV以后,荧光素酶相对活性为2.72±0.45,逆转录聚合酶链反应结果与之相符;全长5’UTRcDNA在L02、hepG2、HEK293、Hela细胞中荧光素酶相对活性分别为0.75,0.49,0.23,0.14。结果提示结构域III是HCV5’UTRDNA序列具备启动子活性的核心结构,结构域I对其5’UTRDNA序列的启动子活性具有抑制效应,而结构域II和IV可增强5’UTRDNA序列的启动子活性;HCV5’UTRcDNA的启动子功能无组织特异性,但在正常的肝细胞(L02)中表达最高。     

RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株;构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6 1,构建shRNA表达载体pSHGFP,转染HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测mRNA水平。结果利用PCR方法从HepG2.GFP细胞基因组DNA中检测到GFP基因;pSHGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pSHGFP能够显著抑制内源性GFP的表达,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。     

抑制Dicer基因对shRNA功能发挥的影响

本文将Dicer基因的RNA酶III结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平。结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达。结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与。     

细菌生物被膜（bacterial biofilm）的研究进展

细菌生物被膜由物体表面集聚生长的细菌群落和细胞外基质构成 ,植入性医用器械表面较多见 ,其结构包括主体生物被膜层、连接层、条件层和基质层。细菌之间的信号传导影响着生物被膜的异化形成。生物被膜相关感染治疗较难 ,易慢性化及反复发作。抗生素或其他化学杀菌剂及金银包裹导管等医用材料表面是常用的预防方法。已形成的生物被膜可用物理方法或某些抗生素清除 ,而生物学控制是另一可能途径。     

鲍曼不动杆菌临床分离株的耐药性及同源性分析

目的 通过对重庆医科大学附属第二医院近4年临床分离的103株鲍曼不动杆菌的耐药性和同源性分析,了解该院鲍曼不动杆菌的耐药性特点及院内感染流行状况.方法 2008年至2011年间该院临床科室分离的103株鲍曼不动杆菌,进行药敏试验并对耐药性分析;提取细菌基因组DNA,以随机扩增DNA多态性(RAPD)方法进行基因分型.结果 药敏试验结果显示分离出的103株菌呈现出高耐药率及多重耐药率的特点,其中对左氧氟沙星和亚胺培南的耐药性最低,分别为69.9％和57.3％.103株多重耐药鲍曼不动杆菌用RAPD分型共分为16种基因型:A～P,其中A型84株,为主要流行型别;B型3株;C型、G型各2株;其余12型各1株.结论 该院鲍曼不动杆菌具有多重耐药及高耐药率,可能存在以A型鲍曼不动杆菌克隆株传播方式的院内流行,临床上应加强对A型鲍曼不动杆菌的监控,采取有效的措施以预防院内感染的爆发流行.     

耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a的质粒克隆与构建

目的克隆并构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）青霉素结合蛋白2a（PBP2a）全长及转肽酶区的原核表达质粒。方法登录基因文库查找获得mecA基因的编码序列,应用PCR技术扩增获得DNA片段,将此基因片段插入PET-32a载体,同时酶切鉴定阳性克隆,DNA序列测定验证序列正确性。结果 PCR扩增获得了mecA基因全长及转肽酶区DNA片段,成功插入到原核表达载体PET32a,双酶切鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确。结论成功构建了PBP2a全长及转肽酶区片段表达质粒,为该蛋白的纯化表达和疫苗研究奠定了基础。     

抑制Dicer基因对shRNA功能发挥的影响

本文将Dicer基因的RNA酶Ⅲ结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2 A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2 A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平.结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达.结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与.     

生物被膜肺炎克雷伯菌产ESBLs的耐药性和基因型分析

目的检测临床分离的肺炎克雷伯菌在体外形成生物被膜后产超广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Laetamases,ESBLs）的情况,分析及研究其耐药性和耐药基因的分型情况。方法采用改良平板法在体外建立肺炎克雷伯菌生物被膜模型,用三维试验确认产ESBLs菌株,用K-B法进行药敏试验,用聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）进行blaSHV、blaTEM和blaCTX—M基因扩增,产物分别克隆人pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,分析其基因亚型。结果临床筛选出的60株ESBLs阴性肺炎克雷伯菌有46株在体外成功建立了生物被膜模型,并有9株产生了ESBLs表型。产酶后菌株的耐药性明显高于产酶前。PCR结果显示9株细菌均携带SHV基因,有4株同时携带TEM基因,没有检出携带CTX-M基因的菌株。9株细菌的SHV基因分别属于SHV-5、SHV-12和SHV-28亚型。4株携带TEM基因的细菌均为TEM-1亚型。结论生物被膜的形成能够诱导肺炎克雷伯菌产生ESBLs。本实验中检出的产ESBLs的基因型都是由SHV-1突变产生的。生物被膜的形成和产生ESBLs的协同作用是生物被膜肺炎克雷伯菌耐药性增强的主要原因之一。     

肺炎克雷伯菌生物膜对单核细胞株THP-1 TLR2受体表达的影响

目的研究肺炎克雷伯菌生物膜对单核细胞株THP-1TLR2受体表达的影响,探索细菌生物膜逃脱宿主免疫防御的机制。方法以体外建立肺炎克雷伯菌生物膜的合成分泌物处理单核细胞株THP－1作为实验组,以等量浮游细菌的合成分泌物处理单核细胞株THP-1作为对照组。RT—PER半定量分析THP－1 TLR2mRNA的表达,流式细胞仪检测分析THP－1 TLR2蛋白的表达。结果实验组THP－1 TLR2 mRNA表达（0．453±0．06）明显低于对照组（4．872±0．36）（P〈0．05）;实验组TLR2蛋白表达率（8．42％±3．74％）明显低于对照组（12．35％±7．36％）（P〈0．05）。结论细菌生物膜与浮游细菌不同的代谢产物能显著下调THP－1 TLR2的表达水平,影响固有免疫进而影响适应性免疫,可能是生物膜细菌逃脱机体免疫防御系统的又一机制。