蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用

泛素-蛋白酶体系统是细胞内蛋白质特异性降解的主要途径,参与并调控细胞周期、免疫应答、信号传递和DNA修复等真核生物体内几乎所有的生命活动。去泛素酶的存在使泛素化修饰成为可逆过程,保证了泛素系统及其相关生理过程的动态平衡,其表达紊乱也是诱发多种疾病的主要原因。对去泛素化酶进行系统、全面的研究是理解其作用机制并将其作为治疗药物靶点的前提。蛋白质组学技术的快速发展为系统深入研究去泛素化酶提供了条件,特别是在去泛素化酶的相互作用网络和底物特异性研究等方面发挥了独特的作用。因此,文中结合课题组研究工作,对去泛素化酶的分类及功能进行介绍并总结了蛋白质组学在去泛素化酶研究中的应用进展。     

量子点的活体皮肤渗透和代谢

皮肤是身体的最大器官,能够直接与含纳米材料的防晒霜、化妆品等接触,但是人们对纳米材料的皮肤渗透性却了解不多.本文研究了水溶性硫硒化镉(CdSeS)量子点对于活体小鼠皮肤的渗透性和其在体内的代谢情况.量子点溶液被涂于雄性ICR鼠背部脱毛部位.荧光显微像和透射电子显微镜被用于观察量子点在皮肤和器官中的分布,电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)用于测量111Cd的含量,以确定量子点在血液和器官中的含量.实验结果表明,量子点能够渗透角质层,并且聚集在角质层的最上面几层角质细胞间和毛囊中.通过血液循环,量子点在肝和肾中沉积严重并且难以清除.如果每只小鼠涂抹0.32nmol量子点,则5天之后肾脏中残存的镉离子浓度仍超过14ng/g.这些结果表明,量子点能够被小鼠透皮吸收,而且对肝和肾产生严重影响.     

小鼠饲养过程中蛋白质组的整体重稳定性同位素标记

文中探讨了稳定同位素代谢标记(SILAC)定量技术在哺乳动物模型上的应用,建立了可用于疾病模型比较蛋白质组学研究的定量内标。用含1%13C6-Lysine的SILAC鼠粮饲养C57BL/6J雌性小鼠,记为F0代,通过与雄性小鼠交配繁殖出F1代,相同方法繁殖出F2代标记小鼠。分离F2代小鼠的大脑、肺脏、心脏、胃、小肠、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉组织,提取各组织的全蛋白,进行蛋白酶Lys-C酶切,利用高效液相色谱串联质谱联用技术(LC-MS/MS)进行鉴定和定量分析。对蛋白质定量结果进行高斯拟合确定均值及标准差,得出不同脏器和小鼠整体的标记效率,肝脏的标记效率最高,为96.34%±0.90%;大脑标记效率最低,为92.62%±1.98%,小鼠整体标记效率为95.80%±0.64%,符合SILAC标记效率不低于95%的国际标准。成功地将SILAC方法从微生物和细胞系水平拓展到哺乳动物模型,这为基于动物模型研究疾病发生、发展机制提供了有力工具。     

中国蛋白质组学研究进展——以人类肝脏蛋白质组计划和蛋白质组学技术发展为主题

蛋白质组学是对细胞或生物体全部蛋白质的系统鉴定、定量并阐释其生物学功能的学科.自21世纪初期开始,随着高精度、高灵敏度和快速扫描质谱仪的出现和快速发展以及微量蛋白质组样品高效分离技术的进步,蛋白质组学获得了快速发展,并在生理过程与病理机制研究等几乎所有生命科学研究领域得到了广泛的应用.过去10年,中国蛋白质组学研究在政府的支持和广大蛋白质组学研究人员的努力下呈现出腾飞式的发展态势.本文综述了人类肝脏蛋白质组计划和2010~2013年中国蛋白质组学技术的发展.     

靶向钠钾ATP酶α1亚单位shRNA质粒表达载体的构建与筛选

构建编码人钠钾ATP酶(Na+/K+-ATPase)α1 mRNA的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体shRNA-ATP1A1(ATP1A11、ATP1A12和ATP1A13),并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.设计、合成靶向ATP1A1的3对DNA序列,分别插入Pgenesil-3中构建3个shRNA表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定确认.筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞荧光检测Na+/K+-ATPase α1表达变化;MTT法和流式细胞术检测沉默效果最明显的ATP1A13对HepG2增殖活性和细胞周期的影响.构建的质粒表达载体酶切鉴定均可扩增出预期条带,测序符合设计要求,构建成功.ATP1A12和ATP1A13对所转染的HepG2细胞中Na+/K+-ATPase α1 mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中ATP1A13最为明显(P<0.05).ATP1A13可抑制HepG2细胞的增殖;转染48和60 h,HepG2细胞细胞周期呈现S期阻滞;实时定量PCR检测ATP1A13敲低HepG2Na+/K+-ATPase α1mRNA呈时间依赖性,72 h后表达降低约90%.试验成功构建靶向钠钾ATP酶α1亚单位的shRNA质粒表达载体,其中shRNA-ATP1A13可显著抑制HepG2细胞增殖引起细胞周期S期阻滞.     

小鼠对量子点的透皮吸收和代谢

皮肤是身体的最大器官,能够直接与含纳米材料的防晒霜、化妆品等接触,但是人们对纳米材料的皮肤渗透性却了解不多．本文研究了水溶性硫硒化镉(CdSeS)量子点纳米颗粒的皮肤渗透性和在体内的代谢情况．将雄性ICR鼠背部脱毛,在脱毛部位涂抹直径约为5 nm、发光波长为620 nm的量子点0.32 nmol,然后检测皮肤和心、肝、脾、肺、肾中量子点沉积量随时间的变化情况．荧光显微像显示,量子点能够堆积在皮肤的表皮层中和真皮层的毛囊和腺体中,电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)结果表明,透皮吸收的量子点能够沉积在器官中,并且肝和肾中沉积的量子点代谢缓慢,涂抹量子点5天之后,肾脏中残存的镉离子浓度仍超过14 ng/g．这些结果表明,量子点能够被小鼠透皮吸收,而且对肝和肾产生严重影响．     

阿糖胞苷对大鼠海马神经元原代培养的影响

目的：探讨在大鼠海马神经元原代培养过程中,阿糖胞苷对培养神经元的影响。方法：将新生24 h大鼠,分离出海马组织,进行原代海马神经元培养,再将细胞分为阿糖胞苷组和对照组,阿糖胞苷组加入1μmol/L阿糖胞苷,通过检测神经元特异性标志物微管相关蛋白-2（Map-2）计算培养神经元的数量,通过台盼蓝染色法观察细胞的存活率。结果：培养第7天,阿糖胞苷组神经元数量为（11±3）个,对照组为（10±4）个,两组无明显差异;阿糖胞苷组神经元细胞在培养第14天时存活率为74%,培养第21天时存活率为49%,而对照组神经元14天时存活率为96%,21天存活率为88%,两组神经元存活率差异明显。结论：原代培养海马神经元时,阿糖胞苷对神经元产量及形态影响不明显,但是由于阿糖胞苷的毒性作用,明显缩短神经元的存活时间,影响长期培养神经元的存活率。