RNA干扰技术对肝癌细胞内源survivin基因表达的影响

应用RNA干扰技术（RNAi）研究针对凋亡抑制因子survivin的siRNA抑制肝癌细胞株内源survivin基因的表达.转染重组质粒pshRNA-survivin至肝癌细胞株SMMC-7721,通过免疫荧光、蛋白质印迹和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化.结果表明：构建的三种重组质粒pshRNA-survivin1/2/3均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin的实验组survivin荧光强度明显低于转染载体pTZU6＋1和pshRNA-GFP对照组;蛋白质印迹结果表明,重组质粒pshRNA-survivin明显抑制survivin蛋白的表达,抑制率为62%～78％,通过半定量RT-PCR检测到survivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为57%～64％.由上述结果可以得出结论：重组质粒pshRNA-survivin可明显抑制SMMC-7721细胞内源survivin的表达和mRNA的转录,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供实验基础.     

RNA干扰技术抑制内源性绿色荧光蛋白的表达

目的建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞株;构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6 1,构建shRNA表达载体pSHGFP,转染HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测mRNA水平。结果利用PCR方法从HepG2.GFP细胞基因组DNA中检测到GFP基因;pSHGFP能够显著抑制该细胞中GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pSHGFP能够显著抑制内源性GFP的表达,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。     

shRNA表达载体构建方法的优化

目的探讨shRNA表达载体的构建方法 ,以加速RNA干扰研究的进程。方法对shRNA表达载体的构建过程进行分析和监测 ,并加以优化。结果发现shRNA表达载体构建的退火过程容易产生障碍 ,经优化退火缓冲液的NaCl含量后 ,能明显提高退火效率及shRNA表达载体构建的成功率。结论shRNA表达载体构建的退火过程需加以关注 ,退火缓冲液中NaCl含量应提高至 2 0 0mmol/L以上为宜