创伤弧菌外膜蛋白免疫刺激复合物对欧洲鳗鲡的免疫保护性分析

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏染色阴性、多形性、运动性、有荚膜的嗜盐性细菌, 属于弧菌属第5群, 主要生长于海水中、鱼类及贝母类等体内1。根据寄主范围和生化反应类型的不同, 将创伤弧菌分为3 个生物型: 生物Ⅰ型(产吲哚)2、生物Ⅱ型(不产吲哚)3以及1999 年以色列的研究人员报道的创伤弧菌生物Ⅲ型。       

创伤弧菌致病性及其毒力因子研究进展

创伤弧菌是一种嗜盐性的革兰阴性弧菌,存在于河海交界之处。自1964年首次被美国CDC分离出后得到了研究者的广泛关注,它与霍乱弧菌、副溶血性弧菌合称为致人类感染的三大弧菌。创伤弧菌可引起肠胃感染、伤口感染及原发性败血症等疾病,其感染存在发病急、病死率高等特点,给公共卫生造成了沉重负担。其中,多种毒力因子在创伤弧菌的致病中起到了至关重要的作用,如溶细胞素、金属蛋白酶、铁载体、荚膜多糖等。因此,本文对创伤弧菌的生物学特性、致病情况及相关毒力因子进行了详细介绍,以期为病原微生物的诊断、预防和治疗提供新的启示。     

响应面分析法优化创伤弧菌生长条件

通过单因素分析,确定最适于创伤弧菌FJ04生长的p H、温度和盐度。在此基础上,综合考虑3个因素对创伤弧菌FJ04生长的影响,用Design-Expert软件进行响应面分析,优化FJ04的培养条件得到了菌体生长模型以及取得模型最优值时各因素的水平。结果表明:创伤弧菌FJ04的最优培养条件p H 8.29、温度32℃、盐度2.38%(质量分数);创伤弧菌生长过程中,温度和p H对创伤弧菌FJ04生长的交互作用显著,p H和盐度、温度和盐度对创伤弧菌FJ04生长的交互作用不显著,偏差度和准确度均在可接受范围内,模型是可靠的。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测创伤弧菌检测方法的建立

环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条(LFD)检测联合应用,建立了一种新的快速、便捷的创伤弧菌检测方法。针对创伤弧菌的外膜蛋白TolC基因设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(FITC)标记的探针。生物素标记的LAMP扩增产物能够特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测。优化后的扩增温度和时间为63℃反应35 min,加上细菌基因组DNA提取步骤,完成检测仅需要80 min。LAMP-LFD方法可特异性地检出创伤弧菌,对哈维氏弧菌等9种水产品常见病原菌的检测均呈阴性;对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.7×102 CFU/mL或7.4 CFU/反应,是利用外引物建立的常规PCR检测的100倍。结果表明,该方法能够准确、快速、灵敏地检出创伤弧菌,可应用于创伤弧菌污染的水产品的检测。     

变性高效液相色谱技术对创伤弧菌检测的研究

应用PCR结合变性高效液相色谱技术对创伤弧菌进行检测,建立创伤弧菌快速准确的检测新方法。经过DHPLC分析条件优化,在DHPLC非变性温度下分析创伤弧菌特异性PCR扩增产物。同时进行方法特异性、灵敏度、重复性实验。实验结果表明所建立的创伤弧菌PCR-DHPLC检测方法特异性强、灵敏度高、重现性好、结果稳定可靠、检测时间短,检测低限可达到124 CFU/mL,是创伤弧菌快速检测的新技术。     

水产品中创伤弧菌DNA环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用

创伤弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要存在于河口和海洋环境中,严重危害水产养殖业的发展和人类健康。建立快速、准确、易操作的检测方法对防控创伤弧菌的传染,保障水产养殖业发展和增强食品安全意义重大。基于创伤弧菌vvHA基因,利用一种新型的核酸扩增技术-环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立了创伤弧菌LAMP快速检测方法。对11种共46株细菌进行扩增,仅创伤弧菌为LAMP阳性结果,说明LAMP方法具有高度特异性。灵敏度试验结果表明,对创伤弧菌纯培养菌的检测灵敏度为15CFU/ml,对污染食品中创伤弧菌的检测灵敏度为24CFU/g。此法40~60min内即可完成检测,检验检疫实践证明:LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高且成本低廉,具有良好的应用前景。     

创伤弧菌抗菌药物药敏实验及结果分析

目的:本研究通过药敏实验对创伤弧菌进行抗菌药物敏感性分析,探讨在创伤弧菌感染中如何选择抗菌药物,提高临床治疗的效果.方法:利用ATCC标准的创伤弧菌菌株,进行了临床常用抗生素单个药敏实验和不同类型抗生素间的2种药物联合药敏实验.结果:创伤弧菌对抗革兰氏阴性菌的抗菌药物比较敏感,这些抗菌药物归属为(1)四环素类;(2)第三代头孢类;(3)第三、四代氟喹诺酮类;(4)新一代氧基糖甙类.四环素和头孢噻肟之间、氨苄西林和左旋氧氟沙星之间、复方新诺明和四环素之间等存在明显的协同关系,左旋氧氟沙星与头孢噻肟及四环素,头孢噻肟与庆大霉素及红霉素均不存在协同作用.结论:临床上主要应用抗菌药物对创伤弧菌感染进行对症治疗,本研究为临床中抗菌药物治疗创伤弧菌感染提供了实验依据,可作为临床用药和提高临床治疗效果的重要参考.     

创伤弧菌毒力相关因子的全基因组关联分析研究

【目的】创伤弧菌是致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。本研究以创伤弧菌分离来源(临床和环境)作为不同表型,通过与260株基因组序列进行关联分析,挖掘毒力相关因子,从而进一步了解创伤弧菌致病因素。【方法】对139株创伤弧菌分离株进行高通量测序,获取其全基因组序列;与公共数据库已公开发表的121株基因组整合,使用pyseer软件进行全基因组关联分析,对与不同分离来源显著相关的基因进行注释和解读。【结果】共发现11个基因与临床分离株显著相关,其中9个是本研究新发现的创伤弧菌潜在毒力相关因子。【结论】本研究使用群体基因组学和统计遗传学方法,在全基因组范围扫描挖掘了创伤弧菌毒力相关因子,为深入揭示该物种致病机制、设计新的疫苗和治疗靶点提供了重要依据。     

战场创伤弧菌感染的预防、检测与治疗

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种的耐盐的革兰阴性弧菌属致病菌。该菌在全球范围内均有分布,通过食品和伤口接触感染患者,对沿海人民的生命健康造成威胁。创伤弧菌高致死、易致残、易在海洋中增殖的特性使其有可能被开发成为生物武器。因此,详尽的预防、诊断和治疗方案是我军生命安全和战斗力的重要保障。本文综述了创伤弧菌的常规诊断方法与治疗手段以及战场中的感染防治管理。     

水产品中创伤弧菌和副溶血弧菌 双重PCR检测方法的建立

目的建立一种同步检测创伤弧菌和副溶血弧菌的双重PCR方法。方法选择副溶血弧菌tlh基因和创伤弧菌vvhA基因作为靶序列各设计一对引物。用合成的引物对副溶血弧菌和创伤弧菌进行双重PCR扩增,确定特异性和最低检出限。然后用此方法对53株副溶血弧菌和7株创伤弧菌进行检测。结果确定了双重PCR检测创伤弧菌和副溶血弧菌的最优反应条件,其中退火温度为60℃,方法具有较好的特异性。对副溶血弧菌的最低限为1.0×10~2 CFU/mL,创伤弧菌最低限为4.2×10~4 CFU/mL。双重PCR对分离株检测符合率达100%。结论建立的双重PCR方法简便、快速、特异性好,可同时检测副溶血弧菌和创伤弧菌,为水产品中病原菌的基层检测提供解决方案。     

恩诺沙星对4种水产致病弧菌的抑杀菌效应

采用二倍稀释法测定恩诺沙星对溶藻弧菌、最小弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌4种12株菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),结果表明:恩诺沙星对12株弧菌的MIC为0.1?0.8 mg/L,MBC为0.4?3.2 mg/L。在此基础上,从每种菌中选取一株对恩诺沙星较为敏感的菌株,研究恩诺沙星不同药物浓度(1 MIC、2 MIC、4 MIC)对4种弧菌的杀菌动力学和抗菌后效应(PAE),结果显示:各浓度恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R菌株均有较强的杀菌作用,而对哈维氏弧菌M071202-H、创伤弧菌Q050723-C、最小弧菌H010911-Z等3菌株却表现出了低浓度抑菌、高浓度缓慢杀菌的作用。恩诺沙星的抗菌后效应PAE与药物浓度及细菌与药物的接触时间成正相关,恩诺沙星对溶藻弧菌X040625-R的PAE最长,对哈维氏弧菌M071202-H的PAE最短。     

创伤弧菌溶细胞素细胞毒性机制的研究进展

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种有荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌,存在于海水及海产品中.该菌主要引起原发性败血症和严重的创口感染.原发性败血症病人多发生低血容量性休克伴多脏器功能衰竭,病死率高.创伤弧菌感染的致病机制至今尚未完全阐明.动物实验发现该菌的毒力可能包含诸多因素,如胞外溶细胞素(VVC)、金属蛋白酶(弹性蛋白分解酶)、荚膜多糖(CPS)等.VVC是由结构基因vvhA编码的一种相对分子质量(Mr)为50 851的细胞外蛋白质,是一种能使细胞形成孔道的细胞毒素和溶血毒素,是创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素,由大多数致病菌株产生,具水溶性,对热不稳定,能溶解哺乳动物红细胞及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,具有血管渗透因子活性.经VVC注射的实验鼠可出现与创伤弧菌败血症病人同样的临床和病理表现,毫克以下水平即可对实验鼠致死.VVC在创伤弧菌感染致病机制中的确切地位尚有争议,但因其具有穿孔特性而颇受人们关注.目前对VVC的细胞毒性机制已有广泛研究和报道,但其确切机制尚未完全明了.本文将近年来国外有关研究的情况作一综述.     

大连地区海生物中致病性弧菌及气单胞菌分布的研究

本文首次报道了大连地区海产品中致病性弧菌及气单胞菌生态分布的研究结果。从152份海产品中共检出88株致病性弧菌及气单胞菌,检出率为57.9％.在检查欧氏六线鱼、太平洋鲱鱼、蓝色马鲛;蝼蛄虾;紫贻贝、杂色蛤仔和毛蚶共7种海产品中,检出9种致病性弧菌和1种气单胞菌,即溶藻弧菌、副溶血性弧菌、麦氏弧菌、少女鱼弧菌、弗尼斯弧菌、拟态弧菌、河弧菌、非01群霍乱弧菌和创伤弧菌。鱼虾类中菌株的检出率明显高于贝类。检出菌株中溶藻弧菌所占比例最高(54.5％),其次为副溶血性弧菌(27.3％)。首次从海生物中分离出嗜水气单胞菌、少女鱼弧菌等致病原因菌株.     

基于转录组测序探索创伤弧菌MO6-24/O小RNA

目的:基于转录组测序注释,探索创伤弧菌MO6-24/O小RNA(sRNA)。方法:在海洋培养基2216E中培养创伤弧菌MO6-24/O,收集从对数生长期到静止期不同时间点的细菌,提取细菌RNA,通过富集sRNA以及去除核糖体RNA进行建库和测序,然后将读段匹配到创伤弧菌MO6-24/O基因组并进行注释,最后进行验证。结果:发现59个顺式编码sRNA、102个反式编码sRNA,并进行了部分验证。结论:鉴定出创伤弧菌MO6-24/OsRNA。     

鲑精蛋白对致病性弧菌的抑制活性

为了解鲑精蛋白对致病性弧菌--副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus BE-98-2029)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae CDC 2164)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus ATCC 27562)的抑菌活性,本文分别测定了2000～4000 μg/mL浓度的鲑精蛋白对三种弧菌在TSB(大豆肉汤)+1.5%NaCl培养基中的生长抑制情况和对菌体的致死时间.试验结果表明,2000 μg/mL鲑精蛋白可有效抑制三种弧菌的生长,使霍乱弧菌48 h内完全死亡,使副溶血性弧菌数量从3.3×106 cfu/mL降至3.3×103 cfu/mL;3000 μg/mL的鲑精蛋白则可以在48h内完全杀死三种弧菌;4000 μg/mL的鲑精蛋白在12 h内使创伤弧菌总数从4.9×106 cfu/mL降至9.4×102 cfu/mL.     

创伤弧菌金属蛋白酶的研究进展

研究表明创伤弧菌产生的金属蛋白酶(Vibrio vulnificus protease,VVP)与创伤弧菌的致病性密切相关。经过纯化的VVP能加强血管的渗透性,而且能破坏血管基底膜而导致严重的出血。VVP能使再生基底膜的胶化下降,使出血组织损伤。VVP前体经过水解氨基末端终止信号肽和前肽而成为成熟蛋白酶。成熟的VVP包含两个功能区域,分别是介导蛋白水解反应的氨基末端多肽片段和介导与靶目标有效连接的羧基末端片段。创伤弧菌有LuxS/AI-2和SmcR两种群体感应(Quorum sensing,QS)系统,均能调控蛋白酶的表达,并且二者之间可能存在相互作用或等级反应。LuxS对创伤弧菌的致病力是必需的,但SmcR却是非必需的。     

低剂量创伤弧菌感染小鼠心肌与骨骼肌电镜超微结构观察比较

目的:观察低剂量创伤弧菌感染小鼠心肌、骨骼肌的超微结构变化,比较创伤弧菌引起的特征性病变下肢水肿骨骼肌病变与心脏病变出现的次序,探讨下肢水肿是否存在与心肌病变有关.方法:16只6～8周ICR(清洁级)小鼠.实验组12只腹腔注射＜LD50(1.34×107个/ml)的菌量(4.45×105个/ml)0.2ml,4只注射生理盐水0.2 ml作为菌液对照.分别取1 h、3 h、6 h、12 h小鼠心肌、后肢骨骼肌肌肉组织0.1cm×0.1 cm×0.1 cm置电镜固定液,超薄切片观察超微结构.结果:引起的动物模型实验组小鼠主要的实质性病变在心肌.实验组3 h就发现肌原纤维间隙扩大,肌丝断裂,肌膜下水肿较明显.6 h肌丝排列紊乱,疏松,局灶性肌丝断裂溶解.12 h核固缩水肿,间隙水肿,肌丝断裂,线粒体肿胀.而骨骼肌肌肉超微结构变化不明显,3 h、6 h和12 h实验组未死亡小鼠只表现肌组织间质变化,肌浆网扩张,组织间质水肿,胶原纤维排列稀疏、溶解.结论:本实验心肌、骨骼肌水肿与临床下肢水肿的症状相吻合,并提示心肌的实质病变明显早于骨骼肌,比较而言创伤弧菌所致病变是以重要脏器心脏的损伤为主,早期创伤弧菌对骨骼肌肌肉的实质性损伤并不明显.由创伤弧菌所致的原发性败血症表现双下肢出血性水肿可能不是创伤弧菌初始病变.     

溶藻弧菌脓毒症1例

创伤弧菌脓毒症是发生在沿海地区的一种少见而又重要的疾病,具有起病急,病情进展快,死亡率高等特点,已引起人们的关注,但有关溶藻弧菌下肢感染致脓毒症的病例国内外罕见文献报告。2003年10月温州医学院附属第一医院收治临床表现酷似创伤弧菌脓毒症的溶藻弧菌脓毒症患者1例,现报告如下。     

六种弧菌多重PCR快速检测方法的建立

目的:检测鳗弧菌、哈氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌六种水产常见病原菌。方法:以toxR-toxS为靶基因设计引物,建立了一种多重PCR(multiplex PCR,mPCR)快速检测方法。结果:本研究设计的mPCR引物特异性强,与其他弧菌及非弧菌无交叉反应,每次反应的敏感性为10-100 CFU(cell forming unit)/每个反应。结论:应用建立的mPCR方法结果稳定可靠,有望成为检测病害弧菌的有效工具。     

海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。