植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

小鼠c-Myc基因的克隆表达及其纯化

目的:克隆小鼠c-Myc基因,构建原核表达载体并对其进行蛋白表达及纯化。方法:以TetO-FUW-OSKM质粒为模板经PCR扩增c-Myc基因,再通过基因重组技术与pET-3C载体相连转化大肠杆菌DH5α。经抗性筛选,PCR鉴定阳性重组子,测序正确后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定分析。结果:DNA电泳结果证实PCR扩增产物与预期大小一致,DNA测序结果显示与GenBank公布的c-Myc基因序列一致,IPTG诱导SDS-PAGE电泳后,在分子量64kDa左右出现诱导后蛋白新增条带,与预测的c-Myc分子量大小一致。结论:成功地构建了pET3C-Myc原核表达载体,表达并纯化出了c-Myc蛋白,为今后研究c-Myc蛋白及相关蛋白诱导体细胞成多能干细胞打下基础。     

鳗弧菌溶血毒素基因vah4的克隆及表达

目的：对鳗弧菌溶血毒素基因vah4进行克隆与原核表达,为进一步深入研究其免疫原性及VAH4的功能奠定基础。方法：PCR扩增vah4,将扩增的产物连接于测序载体pMD18—T上,经测序反应确定无误后,再将PCR产物与原核表达载体pET-32a构建表达VAH4的重组质粒（pET-32a-VAH4）,经PCR鉴定后,再转入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测。结果：含重组质粒的菌株有表达蛋白,其表达的蛋白质相对分子质量为40kDa,并经Western blot鉴定结果证实该条带即VAH4-His融合蛋白。结论：vah4基因成功克隆至pET-32a质粒内并成功表达,为进一步研究其免疫原性、VAH4的毒性作用效果及作用机制奠定基础。     

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL（BLCAP）SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32（a）中,从而构建原核表达重组质粒pET-32（a）-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni^2＋亲和层析纯化回收,并采用SDS—PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32（a）-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。     

人类肥胖基因瘦素蛋白的原核表达

目的：原核表达人类肥胖基因瘦素蛋白,方法：以携人类肥胖基因的pUC119-ob为模拟,PCR扩增瘦素蛋白基因片段,并克隆到pET-32a构建重组表达质粒pET-32a-ob,经酶切和测序鉴定后,转化至大肠埃希菌DH5α中表达,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果：测序和限制性分析均证明了pET-32a-ob的序列正确,转化的DH5α可高效表达一个30kD融合蛋白,与预期结果一致。结论：经pET-32a-ob转化的DH5α可有效表达重组人类瘦素蛋白,为进一步研究瘦素蛋白的生物活性提供了基础。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKXI原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白.方法:根据GenBank中的TaCKXI序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKXl编码基因的批pMD-QRCKXI重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKXI基因的DNA片段.将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKXI已构建成功.提取per-TaCKXI质粒转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件.结果:在大肠杆菌中获得TaCKXI基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.91kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5.2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大.选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白.经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白.结论:小麦TaCKXI基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKXI蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础.     

短短芽孢杆菌几丁质酶BBChi4基因的原核表达及抑菌活性研究

采用生物信息学方法分析短短芽孢杆菌GZDF3菌株几丁质酶BBChi4基因,以GZDF3菌株全基因组DNA为模版设计特异性引物,通过PCR扩增出BBChi4基因的全序列并对其测序验证。将测序验证无误的基因序列连接到原核表达载体(pET-28a),构建重组表达载体pET-28a-BBchi4,转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用打孔法对诱导表达产物进行抑菌活性研究。生物信息学分析显示BBChi4基因全长为2 181 bp,编码726个氨基酸,分子量大小为77.69 kD,等电点为4.83,属于酸性几丁质酶。破碎重组表达菌体上清液SDS-PAGE电泳显示,重组蛋白质分子量大约为78 kD,与生物信息学预测结果一致。诱导表达最佳参数为1 mmol/L IPTG,30℃诱导4 h。破碎重组表达菌体上清液对半夏致病真菌(尖孢镰刀菌)有较强的拮抗作用。重组表达载体pET-28a-BBchi4的成功构建及表达为深入研究几丁质酶的功能提供科学依据。     

弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

以弗氏柠檬酸菌（Citrobacter freundii）基因组DNA为模板,通过PCR得到甘油脱水酶（glycerol dehydratase）基因dhaB、dhaC、dhaE,克隆到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSn-dhaBCE。将此重组质粒转化到E．coli JM109中,重组菌株SDS-PAGE结果显示有明显的61kD、22kD、16kD三条特异性蛋白条带出现。重组菌株经诱导表达,酶活力为11．59U／mL。     

香菇C91-3菌凋亡相关基因24414功能域片段原核表达载体的构建

目的构建高效快速且方便的His-标签原核表达体系,对香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域进行克隆。方法根据香菇C91-3凋亡相关基因24414的基因序列,分别设计特异性上下游引物,采用PCR方法,以24414基因序列为模板,扩增出24414基因的功能域序列。并将功能域基因连入pMD19-TSimpleVector克隆载体中,进行蓝白斑筛选,挑选出阳性菌落,提取质粒经双酶切及PCR验证后,进行基因测序。将克隆载体上目的基因连入pET-32a原核表达载体,构建重组质粒。转化入E．coli JM109宿主菌,经双酶切验证后,进一步测序鉴定验证重组质粒。结果PCR扩增出大小为747bp的基因片段,测序结果显示与香菇C91-3,凋亡相关基因24414的功能域片段同源性为100％,并成功构建了原核表达体系。结论重组原核表达载体pET-32a-24414的成功构建为进一步研究香菇C91-3凋亡相关基因24414功能域的表达纯化及生物学活性奠定了基础。     

重组斑马鱼CD36蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼CD36蛋白胞外区38～432氨基酸残基段并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼CD36蛋白的基因编码区,连接到带有6~His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET28a-CD36,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达,优化表达条件后用Ni^2＋柱进行纯化。结果：构建了pET28a-CD36重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的46．8×10^3。结论：获得了斑马鱼CD36融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

目的:用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系(ScMV-E)外壳蛋白(CP)。方法:用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coliDH5α,经双酶切检测获得阳性克隆。BamHⅠ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片段ScMV-E的CP基因。把目的片段插入表达载体pET29a( ),转化E.coliBL21(DE3),测序。结果:阳性质粒pET29a-CP在E.coliBL21(DE3)中得到大量特异表达。SDS-PAGE分析表明,该蛋白的相对分子质量约36000,与预测一致。结论:以上方法可以得到带6个His标记的目的蛋白,有利于纯化并获取高纯度的ScMV-E的外壳蛋白。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

鹅IL-2基因在大肠杆菌中的表达及其可溶性单体的分离

将去除信号肽编码序列的鹅IL-2基因克隆到原核表达载体pET-28a (+), 构建了重组表达质粒pET-28a (+)-goIL-2, 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了重组鹅IL-2(rgoIL-2)蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示, 表达蛋白的分子量约为15.0 kD, 能被抗鹅IL-2单克隆抗体特异识别。可溶性分析表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在, 部分以可溶形式存在, 非变性电泳可见可溶性蛋白存在单体和多聚体组分。镍柱亲和层析法纯化的rgoIL-2蛋白过滤后, 利用?KTA FPLC(快速蛋白分离纯化系统)进行逐级分离, 非变性电泳可见单一的鹅IL-2可溶性蛋白单体。体外生物学活性分析显示鹅IL-2可溶性蛋白单体能刺激鹅淋巴细胞增殖。这为进一步研究鹅IL-2的生物学功能及其临床应用奠定基础。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

鹅IL-2基因在大肠杆菌中的表达及其可溶性单体的分离

将去除信号肽编码序列的鹅IL-2基因克隆到原核表达载体pET-28a (+), 构建了重组表达质粒pET-28a (+)-goIL-2, 转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了重组鹅IL-2(rgoIL-2)蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western-blotting分析显示, 表达蛋白的分子量约为15.0 kD, 能被抗鹅IL-2单克隆抗体特异识别。可溶性分析表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在, 部分以可溶形式存在, 非变性电泳可见可溶性蛋白存在单体和多聚体组分。镍柱亲和层析法纯化的rgoIL-2蛋白过滤后, 利用?KTA FPLC(快速蛋白分离纯化系统)进行逐级分离, 非变性电泳可见单一的鹅IL-2可溶性蛋白单体。体外生物学活性分析显示鹅IL-2可溶性蛋白单体能刺激鹅淋巴细胞增殖。这为进一步研究鹅IL-2的生物学功能及其临床应用奠定基础。