海洋创伤弧菌反式翻译系统关键因子SmpB基因的克隆及原核表达

创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种重要的"人鱼共患病"病原菌。通过克隆创伤弧菌反式翻译系统核心因子小蛋白B(Small molecular protein B,SmpB)基因,构建携带目的基因的原核表达质粒,为后续研究SmpB蛋白的互作网络、SmpB蛋白与创伤弧菌致病性之间的关系并以此开发新型的抑菌靶标奠定基础。使用LiCl沉淀法提取创伤弧菌基因组DNA,以它为模板,PCR扩增目的基因,并构建到pET-28a原核表达载体上测序鉴定后对SmpB序列进行生物信息学分析,将正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果表明使用LiCl沉淀法成功提取到高质量创伤弧菌基因组DNA,以其为模板,扩增到smpB基因,并成功构建pET-28a原核表达重组质粒,测序鉴定正确;smpB基因全长为486 bp,编码161个氨基酸,分子量为18.41 kD,理论等电点为10.28,不稳定系数为35.02,总平均亲水性为-0.635,SmpB蛋白整体表现为稳定亲水性蛋白。生物信息学分析显示其高级结构核心部分为5个β折叠组成的桶状结构,外围由3个α螺旋组成,SmpB C-端亦为α螺旋。诱导表达的重组融合蛋白相对分子质量大小在25.0 kD附近,显示在E.coli中成功表达了SmpB蛋白。     

红色毛癣菌pho88基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)无机磷酸盐转运蛋白(Inorganic phosphate transporter,PHO88)基因,构建原核表达质粒,并对PHO88蛋白进行生物信息学分析。[方法]根据Gen Bank公布的T. rubrum CBS 118892菌株pho88基因序列(XP-003235348),设计合成特异性引物,提取红色毛癣菌总RNA,反转录为c DNA,PCR扩增pho88基因,构建到原核表达载体p ET-28a上,测序鉴定其序列,并对其进行生物信息学分析。[结果]红色毛癣菌pho88基因全长582 bp,编码193个氨基酸。PHO88蛋白含有1个跨膜结构域,细胞亚定位为分泌信号途径蛋白,PHO88含有16个磷酸化修饰位点,其二级结构主要由α-螺旋构成,高级结构为全α型蛋白质。[结论]成功克隆红色毛癣菌pho88基因及构建原核表达质粒,为后续PHO88蛋白的诱导表达奠定基础,为后续开发靶向PHO88的抗真菌药物,提供实验基础。