胆型螺旋杆菌(Helicobacter bilis)的分离、鉴定与序列分析

鉴定分离到的微需氧菌为螺旋杆菌,并对该菌进行分型。小鼠皮下或肌肉注射地塞米松使其免疫抑制,取小鼠肠内容物培养,对分离到的细菌,经油镜,电镜观察,然后提取细菌DNA,用根据螺旋杆菌（Helicobacter sp.)rRNA保守区设计的引物P7/P8进行扩增,并对扩增产物分别用MboI,HhaI,XspI内切酶酶切,酶切产物用10%PAGE分析。再用根据螺旋杆菌胆型（H.bilis)rRNA设计特异引物P7/Pb扩增,将扩增产物测序分析。最后。将该细菌在Scid小鼠上作动物感染。细菌在油镜下呈鸟翼状,电镜下观察到双极鞭毛。无周质纤毛。引物P7/P8扩增出374bp的特异带,此片段能分别被MboI,HhaI,Zsp内切酶酶切,引物P7/Pb扩增出364bp的条带,测得的DNA序列中存在MboI,HhaI,Xsp内切酶酶切。引物P7/Pb扩增出364bp的条带,测得的DNA序列中存在MboI,HhaI,XspI的内切位点,与文献中H.bilis序列比较,同源性为97.5%。动物感染试验符合Koch准则。分离到的细菌确为胆型螺旋杆菌。     

交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ES0109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3, 16ＳrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性为99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因cel-X全长1479bp,编码一个492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonas haloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有95%的相似性,包括一个糖基水解酶家族5的催化结构域,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现,CelX的最适温度为40 ℃,酶的最适pH在6～7之间。     

猪链球菌2型mrp基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）国外分离株的溶菌酶释放蛋白（Muramidasereleased protein, MRP）的基因序列,设计并合成一对引物,利用PCR技术扩增了江苏分离株的开放阅读框298～827bp间529bp的基因片段,并定向克隆至pET32a(+)表达载体中。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,可表达分子量约42kD的蛋白。经过镍亲和层析柱层析,获得纯化的重组蛋白。以重组蛋白免疫Balb/c小鼠,以5LD50猪链球菌强毒株攻击后小鼠的相对存活率达625%。证实所表达的MRP片段为重要的保护性抗原。     

藏羊肖氏隐孢子虫的分离鉴定

为了解隐孢子虫在藏羊中的感染情况,采用饱和蔗糖漂浮法检查34份藏羊新鲜粪便。通过巢式PCR扩增阳性分离株的18S rRNA、HSP70和CpA135位点基因,并采用限制性内切酶Ssp I和Vsp I对18S rRNA产物进行酶切分析。同时构建系统发育树,分析藏羊感染隐孢子虫类别。结果显示仅1只藏羊感染隐孢子虫,18S rRNA与Cryptosporidium xiaoi山羊分离株(GU553016)相似率为99.9%;HSP70与C.xiaoi绵羊分离株(FJ896041)相似率为98.7%;CpA135与C.ubiquitum人源分离株(HM358023)相似率为99.3%。18S rRNA产物经Ssp I酶切后获得3条条带493 bp、262 bp和103 bp,经Vsp I酶切后获得3条条带508 bp、181 bp和104 bp,与C.bovis酶切条带相似。基于18S rRNA和HSP70的系统发育分析显示,该分离株与C.xiaoi亲缘性最近。这是首次在藏羊体内发现肖氏隐孢子虫。     

基于PCR-RFLP技术鉴定常见食源性致病菌

根据细菌核糖体基因16S rRNA保守端400 bp大小区段特征设计引物,应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立一种新型灵敏的食源性致病菌鉴定技术。首先用特异性引物对9属19种细菌基因进行PCR扩增,扩增产物应用7种限制性内切酶Eco52Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ进行消化酶切,再利用琼脂糖凝胶电泳分辨酶切DNA片段大小数目,分析不同种属细菌酶切产物态型,从而进行基因型鉴别,针对16S rRNA基因片段利用RFLP进行分析,结果表明:19种致病菌表现出10种特异性的RFLP图谱,可准确鉴定区分9属细菌,最低检测限可以达到1 pg/μL。这证明PCR-RFLP技术可用于常见食源性致病菌的快速鉴定。     

甜菜银叶病菌的PCR检测

本研究用16S23S rDNA间的ITS 序列通用引物L1（5′AGTCGTAACAAGGTAGCCGT3′）和L2 （5′ GTGCCAAGGCATCCACC3）扩增甜菜银叶病菌（Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae,Cfb）和其它相近细菌的基因组DNA;并对其PCR产物进行回收、克隆和测序,将所获序列和其它已报道的细菌内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer,ITS)序列进行多重比较后设计出Cfb的特异性引物B1（5′GGCCTCGTGTTGTCCCTTATC3′）和B2 （5′GTCACCAATCAACAACCCGAG3′）。此引物可以从Cfb中扩增出387bp 的特异性片段,而其余参试的21个细菌PCR反应结果均为阴性。该方法可以应用于病害防治工作中的Cfb快速、可靠的检测。     

应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性

通过保守的寡核苷酸引物B1/B3扩增出油菜菌核病菌MBC^HR和MBC^S菌株的部分β-微管蛋白基因,结果发现编码的198位氨基酸由Clu(GAG)突变为Ala(GCG),表现高水平抗药性。根据MBC^HR菌株的突变设计2个快速检测方法：第一种方法是根据MBC^HR菌株197和198位密码子（GACGAG→GACGCG）形成HhaI酶切点（3'CGCG 5'）,将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段,而MBC^S菌株的PCR产物不被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3'末端碱基设计2个等位基因特异性寡核苷酸引物（ASO）用一地“nested”PCR或直接从基因组DNA扩增。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测油菜菌核病菌的MBC^HR和MBC^S菌株,所得结果与传统菌落直径法相吻合。     

节杆菌BT801基因文库构建及其乙内酰脲酶基因分离与表达

L-乙内酰脲酶产生菌节杆菌 BT801的染色体DNA经Sau3A I 部分酶切后分离30kb左右的片段,与经HpaI和PstI酶切的黏粒载体Pkc505进行连接,将连接产物用包装蛋白包装,转染大肠杆菌DH5α得到10 000多个转化子,构建成节杆菌BT801的基因组文库。通过薄层层析等方法筛选得到了1个阳性克隆,通过亚克隆得到了乙内酰脲酶的完整基因,该基因能分别利用自身的启动子和T5启动子在大肠杆菌中进行表达产生有活性的蛋白。     

垃圾填埋场中厌氧真菌18S rDNA的PCR扩增及鉴定

采用机械破壁法直接从来自 7个不同地区的垃圾填埋场滤液样本中提取真菌DNA ,应用真菌通用引物NS1和NS8扩增 18SrDNA(约 180 0bp) ,多聚酶链式反应 (PCR)产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明所有的样本均得到了扩增 ;以PCR产物作为模板 ,采用厌氧真菌Chytridiomycetes科的专用引物Chyt 719和Chyt 15 5 3进行二次PCR扩增 (约 85.7bp) ,该阳性扩增产物克隆和测序结果首次表明在食草动物瘤胃中存在的厌氧真菌Chytridiomycetes也存在于垃圾填埋场中 ,且为Neocallimastix属     

油菜内生细菌16S核糖体DNA的RFLP分析

植物内生细菌定殖在植物组织内部但不引起明显的病害症状。从健康油菜植株的不同器官中分离到大量内生细菌,这些细菌菌落形态存在明显的差异,表明油菜组织中存在大量内生细菌,且类群丰富。分离到的122株内生细菌根据菌落形态可以划分为35类;利用细菌通用引物对16S核糖体DNA进行扩增, 获得约15 kb片段,分别用内切酶HaeⅢ和MspⅠ对扩增产物进行限制性酶切,产生不同的酶切图谱,根据酶切图谱聚类分析结果,所有供试菌株被归为39类,这一结果从遗传上显示油菜内生细菌类群的多样性。两种方法归类结果比较发现菌落特征所反映的信息量有限,只能作为初步的参考指标,核糖体DNA的限制性片段长度多态性分析快速、准确,可以作为油菜内生细菌多样性分析的一种有效方法     

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因2.1kb片段在大肠杆菌中的表达

以棉铃虫颗粒体病毒(Helicoverpa armigera granulosis virus,简称HaGV)基因组DNA为模板,设计引物PCR扩增病毒增效蛋白(Enhancin)基因,然后经SacI/PstI双酶切消化,得到5′端截短的约2.1kb增效蛋白基因片段,再与pQE30质粒连接,构建了重组表达载体pQE/EnC,转化大肠杆菌M15(pREP4),在IPTG诱导下表达出分子量约为78×10³ D的融合蛋白并命名为P78,纯化的P78包涵体显示了明显的增效活性,可提高AcMNPV对小菜蛾幼虫的感染率27.88%～32.92%。     

一种短杆状耐辐射菌的分离与鉴定

从北京地区公园湖岸土壤中分离到一株橙红色杆状耐辐射菌,细胞壁革兰氏染色为阴性,电镜显示菌体大小为06μm～16μm,略大于日本学者报道的Deinobacter grandis菌,过氧化氢酶的含量和分子量不同于D.radiodurans R1菌,分离菌的(G+C)mol%含量为707%, 16S rDNA序列分析表明,分离到的杆状耐辐射菌(RR5332)16S rRNA基因序列与Deinobacter grandis菌高度同源,提示RR5332归于Deinobacter菌属,并可能是该菌属中的一个新种。     

一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌方法的建立与初步评价

目的建立一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法。方法采用经全自动微生物鉴定系统和分子生物学方法准确鉴定的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各3株,提取细菌DNA,PCR扩增tuf基因,扩增产物Alu I、Hinf I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,分析不同葡萄球菌酶切后带型的差异。收集临床分离葡萄球菌142株,采用建立的PCRRFLP对其进行分类鉴别,随机选择分类鉴别的葡萄球菌各20株,PCR扩增16S r DNA,扩增产物测序,将结果与Gen Bank数据库进行比对,初步评价该方法的准确性。结果金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,溶血葡萄球菌均能扩增出长668 bp DNA片段。扩增产物经Alu I、Hinf I双酶切后电泳条带不同,金黄色葡萄球菌出现三条带（108 bp/192 bp/217 bp）,表皮葡萄球菌出现两条带（192 bp/304 bp）,溶血葡萄球菌出现两条带（192 bp/217 bp）。PCR-RFLP结果显示,142株葡萄球菌中金黄色葡葡球菌、表皮葡葡球菌和溶血葡葡球菌分别为67、29和46株。随机挑选的20株不同种葡萄球菌16S r DNA测序结果与Gen Bank数据库对应序列的相似性均〉99%,说明建立的PCR-RFLP方法能准确区分三种常见葡萄球菌。结论 PCRRFLP能准确鉴别临床常见的致病性葡萄球菌,为葡萄球菌病的分子诊断奠定了基础。     

一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢,采用PCR-RFLP技术,对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢和斑鳢线粒体全序列,发现1处单核苷酸多态性位点,可以明确区分两个物种。利用1对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域进行PCR扩增,用限制性内切酶EcoR I分别对扩增产物进行酶切,并用1.5%的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP检测结果显示,斑鳢的PCR扩增产物被EcoR I酶切后生成两个不同大小的片段,分别为315 bp和875 bp,乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢在酶切图谱上鉴别出来。     

蚕豆叶绿体DNA BamH I克隆库的构建及含16S-25S rRNA基因克隆的分析

蚕豆叶绿体DNA(ct—DNA)经BamH I酶切产生26个片段,最大的为14．00kb,最小的为0．42kb。本文以pBR322为载体,E．Coli HB101为受体菌,采用标准分子克隆法构建了蚕豆ct—DNA BamH I克隆库,并从库中分离得到含叶绿体rRNA基因的克隆。32P标记的E．Coil 16S、23S rRNA能和蚕豆ct—DNA BamH I第6(B₆,5．65kb)和第9(B₉,4．70kb)个片段杂交,含有这二个片段的克隆分别命名为pVFB32和pVFBl6。利用几种限制性内切酶酶切和Southern印迹法构建了pVFBl6的物理图谱。pVFBl6电镜下观察到有一变性环(A—T丰富区),经Hind I酶切,电镜观察定位此A—T丰富区位于16S和23S rRNA基因的间隔顺序内,推测该环可能与DNA复制有关。     

分子标记辅助选择不同甜瓜性别植株

运用A和G基因鉴定甜瓜的性别类型,为甜瓜其他性状的分子标记辅助育种提供方法。根据已发表的甜瓜CmACS-7(A基因)与WIP1+Gyno-hAT(G基因)基因结构设计PCR引物,对47个重组自交系群体家系及14份甜瓜材料进行检测验证。引物CmACS-7扩增产物在383 bp进行酶切,基因型为AA不能被酶切,扩增产物均被酶切的为基因型aa,酶切位点可分辨共显性基因型;针对WIP1+Gyno-hAT基因结构设计2对引物同时扩增,扩增条带197 bp和184 bp区别G(g)基因基因型。利用自主设计的引物可用于甜瓜苗期筛选雌雄异花同株、全雌系、雄全同株和完全花植株的分子标记辅助选择育种。     

利用反向PCR方法扩增细菌热激蛋白HSP60基因

利用PCR简并引物扩增出HSP6 0基因中一段约 6 0 0bp的核心片段 ,将该核心片段标记为探针 ,与基因组DNA进行Southern杂交 ,选择出适宜的限制性内切酶 ,以便消化基因组DNA得到大小合适的、含有HSP6 0基因的酶切片段。将酶切片段自身环化后作为模板进行反向PCR ,引物的延伸方向自核心片段出发延环化分子向未知序列区进行 ,可扩增出核心区上下游的序列。应用该方法 ,扩增并测定了寓齿双歧杆菌 (Bifidobacteriumdenticolens)DSM1 0 1 0 5 T、奇异双歧杆菌 (Bifidobacteriuminopinatum)DSM1 0 1 0 7T 和阴道加德纳氏菌 (Gard nerellavaginalis)ATCC1 40 1 8T 的HSP6 0全基因序列及青春双歧杆菌 (Bifidobacteriumadolescentis)JCM1 2 75 T98%以上的HSP6 0全基因序列。结果表明 ,反向PCR方法可有效的扩增细菌HSP6 0基因     

扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的克隆与表达

利用PCR技术,从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase）基因 (BGL1),长度为2596 bp,连接到pGEMT载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使之位于α-因子信号肽下游,且与之同框, 构建成重组质粒pSHL9K。 通过电转化将重组质粒pSHL9K插入到Pichia pastoris GS115菌株染色体中,获得高效表达BGL1基因的毕赤酵母重组工程菌株。重组酶的最适温度为50℃,最适pH为5.4。培养基中β-葡萄糖苷酶活性最高可达47U/mL。     

海藻糖合酶产生菌筛选、鉴定及目的基因克隆

目的:为筛选出一株产海藻糖合酶的菌株,并以此菌的全DNA为模板,克隆出产海藻糖合酶的目的基因片段。方法:实验过程中采用了常规筛选菌种、快速提取细菌全基因、显微镜观察菌种、热启动PCR技术、电泳纯化回收基因片段、EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段等方法。结果:在电镜下可观察到有芽孢、杆菌;菌株16S rRNA基因扩增产物共计1490个碱基;PCR方法扩增出阳性克隆大约1700bp的基因片段。结论:通过生理、形态、结构特征分析及16S rRNA基因全序列比较得出结论:筛选到一株短小芽孢杆菌;PCR扩增出阳性克隆片段,全长1722bp,为实验所要的编码海藻糖合酶的基因片段。     

菊粉酶酶源菌株筛选及其基因克隆

筛选出一株产菊粉酶酶源菌株AF10,鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。PCR扩增AF10的内切菊粉酶基因inuA1并进行核苷酸序列分析。结果表明inuA1全长1551bp,没有内含子,所编码的氨基酸序列中,存在4个潜在的N糖基化位点,其中存在菊粉酶的保守序列WMNEPN。以pUC118为克隆载体,以E.coli JM109为受体菌株,获得菌粉酶基因克隆。