交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆

从深海样品ESO109中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3,16SrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas sp．)的Pseudoalteromonas citrea和Pseudoalteromonas elyakovii的同源性为99％。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因celX全长1479bp,编码一个492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Rseudoalteromonas haloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有95％的相似性,包括一个糖基水解酶家族5的催化结构域,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现,CelX的最适温度为40℃,酶的最适pH在6～7之间。     

性逆转石斑鱼脑垂体差异表达基因克隆的筛选

以17α甲基睾丸酮投喂赤点石斑鱼(Epinephelusakaara),成功地获得了性逆转的有功能的雄鱼。用SMARTcDNA合成和长片段PCR技术构建了性逆转前后脑垂体cDNA文库;用抑制消减杂交技术建立了性反转前后抑制性差减文库。对获得的560个雄鱼脑垂体PCR阳性克隆和350个雌鱼脑垂体PCR阳性克隆进行斑点杂交,共筛选到103个差异表达cDNA片段。对其中29个克隆进行了测序,与GenBank中的已知基因序列进行同源性比较,发现有6个片段为促性腺激素α亚基前体基因(GenBank注册号:AY207430),与同属不同种的石斑鱼促性腺激素α亚基前体基因有97%的同源性;1个片段为生长激素前体(GenBank注册号:AY207431),与同属不同种的石斑鱼生长激素前体基因有99%的同源性;其余22个cDNA片段与GenBank中的序列无明显同源性 。     

石斑鱼性反转相关基因 ECaM的克隆及表达特征分析

用甲睾酮片饲喂 2 ～ 4 龄赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) , 6 周后 90% 以上的雌鱼性逆转为功能性雄鱼 . 运用抑制性差减杂交技术 (SSH) ,结合 SMART cDNA 合成和 RACE-PCR 方法,从性反转雄鱼性腺中克隆到钙调蛋白基因 (ECaM). 该基因 cDNA 全长为 582 bp ,开放阅读框长 450 bp ,编码的蛋白质由 149 个氨基酸组成, 5 ′端非编码区 74 bp , 3 ′端非编码区 58 bp. 虚拟 RNA 印迹表明, ECaM 在性反转雄鱼性腺中表达,而在正常雌鱼性腺中表达微弱 . 各种组织的半定量 RT-PCR 显示, ECaM 在脑、心、肝、脾、肾都有转录,在精巢和下丘脑中表达水平较高,而在肌肉中表达甚弱 . 性反转不同时期性腺的半定量 RT-PCR 及蛋白质印迹表明,性逆转过程中性腺里 ECaM 的表达量逐渐增加 . 上述结果提示钙调蛋白可能在赤点石斑鱼性逆转过程中发挥着作用, ECaM 可能是促使石斑鱼由雌向雄转变的重要功能基因之一 .     

嗜热菌Thermus sp.YBJ-1的分离和淀粉酶基因的克隆

从西藏热泉水样分离得到一株嗜热菌(YBJ-1),其16S rDNA(1511bp)序列与栖热菌(Thermus scotoductus ITI-252T)的同源性为98％。通过PCR技术将Thermus sp．YBJ-1的淀粉酶基因(amyT)全长开放阅读框克隆到T载体。分析表明,amyT的ORF全长为1767bp,编码588个氨基酸。推导的氨基酸序列与嗜热脂肪芽孢杆菌的阿尔法环糊精酶(Bacillus stearothermophilus alpha-eyclodextrinase)和栖热菌Thermus sp．IM6501的麦芽糖淀粉酶(Thermus sp．IM6501 mahogenic amylase)分别有99％和96％的同源性,与嗜热脂肪芽孢杆菌的新普鲁兰酶(neopullulanase)的同源性为81％。     

性逆转石斑鱼性腺差异表达基因的克隆和筛选

以 17α 甲基睾丸酮 (17α MT)饲喂 2～ 4龄赤点石斑鱼 (Epinephelusakaara) ,成功地促使其性转变为具有生殖功能的雄鱼 .应用抑制性差减杂交 (SSH)技术构建了石斑鱼性反转前后性腺组织的SMARTcDNA文库及其cDNA差减文库 ,从中随机挑取 12 0 0个克隆进行了PCR和斑点杂交筛选 ,得到 12 0个差异表达cDNA片段 .挑选 71个cDNA克隆测序 ,将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较 ,发现有 5 1个cDNA片段序列无明显的同源性 ,2 0个片段与报道的基因有较高同源性 .在这 2 0个具同源性的片段中有 3个片段可能是与性别分化密切相关的重要功能基因 ,它们是钙调蛋白基因、活性蛋白激酶C受体基因和一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 .这 3个基因被分别命名为鱼钙调蛋白基因 (GenBankaccession :AY2 8136 3)、鱼活性蛋白激酶C受体基因 (GenBankaccession :AY2 8136 4)和鱼一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 (GenBankaccession :AY2 8136 5 ) .     

一个含WD结构域蛋白的基因在鱼类卵子发生过程中的差异表达及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE-PCR技术的综合方法,从鱼类卵母细胞卵黄形成后期差减文库中克隆到一个新的含WD结构域蛋白的基因.该基因cDNA全长为1870bp,可读框长990bp,编码的蛋白质由329个氨基酸组成,含有6个WD结构域;5′非编码区长210bp,3′非编码区长670bp,有脊椎动物典型的ANNATG起始序列和polyA加尾信号AATAAA.由于其编码的蛋白质与STRAP蛋白(serine-threonine kinase receptor- associated protein)有92%的同源性,所以把它称为FSTRAP (fish STRAP).虚拟Northern杂交表明,FSTRAP在卵母细胞的卵黄形成后期表达,而在卵黄形成前期(Ⅰ时相卵母细胞)不表达.各种组织的RT-PCR显示,FSTRAP在脑、心、肾、肌肉、卵巢、脾和精巢有转录,而在肝脏中未见扩增带.不同发育时相卵母细胞的RT-PCR表明, FSTRAP在第Ⅱ~Ⅴ时相都有转录.Western杂交也显示FSTRAP在除肝组织外的多种组织中都表达,与RT-PCR结果相同,FSTRAP在卵黄形成前期几乎不表达,从第Ⅱ时相开始表达,且与其转录水平一致.