一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌方法的建立与初步评价

目的建立一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法。方法采用经全自动微生物鉴定系统和分子生物学方法准确鉴定的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各3株,提取细菌DNA,PCR扩增tuf基因,扩增产物Alu I、Hinf I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,分析不同葡萄球菌酶切后带型的差异。收集临床分离葡萄球菌142株,采用建立的PCRRFLP对其进行分类鉴别,随机选择分类鉴别的葡萄球菌各20株,PCR扩增16S r DNA,扩增产物测序,将结果与Gen Bank数据库进行比对,初步评价该方法的准确性。结果金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,溶血葡萄球菌均能扩增出长668 bp DNA片段。扩增产物经Alu I、Hinf I双酶切后电泳条带不同,金黄色葡萄球菌出现三条带（108 bp/192 bp/217 bp）,表皮葡萄球菌出现两条带（192 bp/304 bp）,溶血葡萄球菌出现两条带（192 bp/217 bp）。PCR-RFLP结果显示,142株葡萄球菌中金黄色葡葡球菌、表皮葡葡球菌和溶血葡葡球菌分别为67、29和46株。随机挑选的20株不同种葡萄球菌16S r DNA测序结果与Gen Bank数据库对应序列的相似性均〉99%,说明建立的PCR-RFLP方法能准确区分三种常见葡萄球菌。结论 PCRRFLP能准确鉴别临床常见的致病性葡萄球菌,为葡萄球菌病的分子诊断奠定了基础。     

四种鲟鱼线粒体PCR-RFLP鉴定方法的研究

利用线粒体序列开发高效准确的分子鉴定方法广泛应用于水产品易混物种的鉴定中。应用PCR-RFLP技术,对鲟鱼易混种开展了分子生物学鉴定方法研究。结果表明,利用一组引物对8种鲟鱼线粒体基因进行PCR扩增,分别应用限制性内切酶TaqαI、Ava II和Eag I-HF、Nae I对扩增产物进行酶切,并用3.0%的琼脂糖凝胶检测PCR产物的酶切结果,可从8种鲟鱼易混种中分别鉴别出中华鲟、小体鲟、达氏鳇以及欧鳇。所建立的方法操作简单,在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条,便可快速准确地进行常见鲟鱼和不同鲟鱼产品的鉴别,大大增加了鉴定结果的准确性和可信度,极大地提高了工作效率。     

斑鳢、乌鳢及其杂交种遗传差异的AFLP分析

本文采用AFLP分子标记技术对斑鳢、乌鳢和杂交鳢(斑鳢(母本)与乌鳢(父本))共85个个体(其中斑鳢、乌鳢各30个,杂交鳢25个)进行了遗传差异分析。结果表明11对引物组合共检出了459个不同的扩增片段,扩增出的多态谱带数350条,多态性比例为76.25%,平均每对引物组合扩增出31.8条多态条带。乌鳢与斑鳢种群间存在稳定的、可以简单地借以进行群体鉴别的标记条带169条,其中父本(乌鳢)特异性条带78条,72条能够稳定地遗传给杂交鳢;母本(斑鳢)特异性条带89条,71条能够稳定地遗传给杂交鳢。杂交鳢另外出现了3条非双亲的条带。遗传差异的分子方差分析结果发现,斑鳢与乌鳢种群间的遗传相似度为0.5161,杂交鳢与斑鳢和乌鳢种群间的遗传相似度相近,分别为0.7189和0.7476,斑鳢与乌鳢之间以及杂交鳢与斑鳢和乌鳢之间的种群间遗传距离分别为0.6615、0.3300和0.2909,即AMOVA分析显示斑鳢、乌鳢和杂交鳢间存在极显著的遗传分化。UPGMA聚类分析显示,在个体间,斑鳢与乌鳢能区分成两大类,杂交鳢则分散于斑鳢和乌鳢种群中;在群体间,杂交鳢首先与乌鳢聚类,然后与斑鳢相聚,表明杂交鳢种群总体上更偏向于父本乌鳢。研究结果表明,杂交鳢与斑鳢和乌鳢发生混杂的可能性很大,应该对杂交鳢进行隔离养殖。本文结果将为斑鳢、乌鳢和杂交鳢的遗传分析提供实验依据,也为其种质的合理利用提供参考。     

乌鳢和斑鳢微卫星制备及其对自交与杂交F1代的初步鉴定

通过磁珠富集法分离了乌鳢(Channa argus)和斑鳢(C.maculate)的微卫星DNA序列,根据这些微卫星DNA序列的两翼序列,采用Primer 3.0或Primer 5.O软件设计出乌鳢与斑鳢的微卫星引物各31对.用62对微卫星引物对乌鳢和斑鳢自交与杂交F1代的4个组合进行扩增,10对引物无扩增产物,其余5...     

利用mtCOI PCR-RFLP技术鉴别草地贪夜蛾与其他3种形态相近昆虫

【目的】田间调查发现草地贪夜蛾与甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、粘虫常混合发生,传统的形态学鉴定方法不能快速鉴别出该虫,当前亟需快速鉴别该虫的方法。【方法】本研究分析了草地贪夜蛾与甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、粘虫mtCOI基因序列的酶切位点,根据目的片段设计上游引物并进行PCR-RFLP验证。【结果】草地贪夜蛾个体在mtCOI片段的556~561 bp处均存在Sbf I内切酶酶切位点,斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫均无Sbf I酶切位点。草地贪夜蛾PCR产物经过Sbf I内切酶酶切,可出现420 bp左右的特征带,斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、粘虫种群均不能被Sbf I内切酶酶切。【结论】基于新设计引物扩增的mtCOI片段的PCR-RFLP方法可有效鉴别草地贪夜蛾与其他3个形态相近昆虫,研究结果为草地贪夜蛾的快速鉴别提供了方法。     

PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究

目的建立检测常见丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP和多重PCR方法。方法建立以PCR技术为基础的限制片段长度多态性(RFLP)方法 ,首先用真菌通用引物扩增丝状真菌的ITS区,然后用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切。用4种丝状真菌的特异性引物建立多重PCR体系,用该体系检测单模板、双模板和三模板的扩增情况,并测定该体系的特异性和敏感性。结果用PCR-RFLP技术能够鉴别5种常见丝状真菌,多重PCR能够根据扩增片段的不同鉴别菌种,在合适的反应条件下,对单模板、双模板和三模板均能扩增出目的片段。结论 PCR-RFLP和多重PCR技术能够快速鉴定丝状真菌感染病原菌,有临床应用的良好前景。     

华中五昧子AFLP反应体系的建立

目的:建立一个适于华中五味子研究用的AFLP反应体系.方法:以华中五味子硅胶干燥嫩叶为试材,采用改良CTAB法提取到高质量DNA.通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对Mse I/EcoR Ⅰ双酶切、连接、预扩增和选择性扩增过程中的关键因素进行分析.结果:双酶切6 h,片段主要集中在250～2 000bp;连接产物和预扩增产物最适稀释倍数均为10倍;预扩增产物经选择性引物E-ACF/M-CAT和E-ACA/M-CAG扩增,琼脂糖电泳检测其主带分别集中在250～375 bp和500～750 bp,6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及银染,条带清晰可辨.结论:该体系具有稳定性高、重复性好等优点,可用于华中五味子AFLP分析.     

基于PCR-RFLP技术鉴定常见食源性致病菌

根据细菌核糖体基因16S rRNA保守端400 bp大小区段特征设计引物,应用聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法建立一种新型灵敏的食源性致病菌鉴定技术。首先用特异性引物对9属19种细菌基因进行PCR扩增,扩增产物应用7种限制性内切酶Eco52Ⅰ、HindⅢ、MboⅠ、MluⅠ、PstⅠ、SalⅠ和XbaⅠ进行消化酶切,再利用琼脂糖凝胶电泳分辨酶切DNA片段大小数目,分析不同种属细菌酶切产物态型,从而进行基因型鉴别,针对16S rRNA基因片段利用RFLP进行分析,结果表明:19种致病菌表现出10种特异性的RFLP图谱,可准确鉴定区分9属细菌,最低检测限可以达到1 pg/μL。这证明PCR-RFLP技术可用于常见食源性致病菌的快速鉴定。     

PCR-RFLP和PCR-SSCP方法对弱精子症精子mtATPase6基因突变的检测

为了检测弱精子症精子mtATPase6基因突变,采用PCR方法扩增了17例弱精子症mtDNA8602～9416区域815bp目的片段,用MspI和HaeⅢ限制性内切酶酶切,分别用琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和单链构像多态性(SSCP)筛查突变。筛选出3例突变标本,经测序确认突变位点和突变性质。结果显示17例标本全部扩增出mtDNA8602～9416的815bp目的片段,PCR产物经MspI限制性内切酶酶切后电泳结果与剑桥序列预期酶切图谱相一致。PCR产物经HaeⅢ酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上出现泳动带的异常,在17例弱精子症中共筛选出2例酶切片段异常标本。PCR-HaeⅢ酶切产物的SSCP电泳图谱分析结果显示,在PCR-RFLP(HaeⅢ)电泳图谱正常的15例弱精子症标本中筛选出1例异常。两种方法在弱精子症精子标本中筛选出mtATPase6基因突变3例(3/17,17.7%)。3例测序结果发现A8701G、C8943T、C8964T、T8966C、G9053A、C9060A、C9075T、A9120G、C9296T共9个点突变,其中A8701G、T8966C、G9053A三个突变为错义突变,其余均为同义突变。上述结果提示,弱精子症精子mtATPase6基因存在较高突变率;PCR-RFLP和PCR-SSCP能简单、快速、灵敏地筛选mtATPase6基因突变。     

用分子生物学技术对草菇进行菌株鉴别

利用AP-PCR和RAPD技术对三个草菇菌株进行鉴别,其结果与用草菇菌株V34基因文库中的中等重复序列为探针进行限制性内切酶长度多态性分析(RFLP),及对编码核糖体5.8SrRNA的DNA(rDNA)进行PCR扩增后的产物进行限制性内切酶长度多态性分析(PCR-RFLP)的结果相一致。这一结果显示出用这四种方法对草菇菌株进行鉴别具有相似的效果。同时用这四种方法构建的分子生物学标记显示出这三个菌株中的两个菌株在遗传上有着较大程度的相似性。     

感染性猪圆环病毒2型基因组DNA的分子克隆

本研究通过PCR扩增出猪圆环病毒2型(PCV—2)的全基因组(1768bp),克隆入pcDNA3载体的EcoR I酶切应点,获得含有PCV-2全基因组的重组质粒,命名为pcDNApcv2。将重组质粒大量扩增后,用EcoR I切出1768bp的PCV—2全基因组,在体外用T4DNA连接酶使其连接环化。用脂质体法将体外连接产物转染无PCV污染的PK—15细胞,经4次连续传代,用间接免疫荧光实验(IFA)及电镜观察证实已获得复制能力的PCV—2病毒。由此可见,本试验构建的环化的PCV—2全基因组DNA具有感染性。     

分子标记辅助选择不同甜瓜性别植株

运用A和G基因鉴定甜瓜的性别类型,为甜瓜其他性状的分子标记辅助育种提供方法。根据已发表的甜瓜CmACS-7(A基因)与WIP1+Gyno-hAT(G基因)基因结构设计PCR引物,对47个重组自交系群体家系及14份甜瓜材料进行检测验证。引物CmACS-7扩增产物在383 bp进行酶切,基因型为AA不能被酶切,扩增产物均被酶切的为基因型aa,酶切位点可分辨共显性基因型;针对WIP1+Gyno-hAT基因结构设计2对引物同时扩增,扩增条带197 bp和184 bp区别G(g)基因基因型。利用自主设计的引物可用于甜瓜苗期筛选雌雄异花同株、全雌系、雄全同株和完全花植株的分子标记辅助选择育种。     

肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的PCR法鉴定

肺炎链球菌是一种致病率和致死率很高的病原菌 ,若无丰富临床检测经验从临床标准中分离鉴定此菌较困难 ,本实验以寡核苷酸引物YH1 YH2、YH7 YH8分别扩增肺炎链球菌自溶素和溶血素基因的 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,通过改变各种反应条件 ,建立了这两种病原因子基因的PCR检测方法。用此方法对 2 0株肺炎链球菌标准菌株及 7株对照菌株进行了鉴定 ;其扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和和AccI进行酶切以确认扩增产物是否正确 ;用酚 氯仿抽提纯化的全细胞DNA对PCR方法的检测灵敏度进行了测定 ;并利用此方法对 2 8份临床标本分离物进行了鉴定。结果　所有 2 0株肺炎链球菌均可分别用引物YH1 YH2、YH7 YH8扩增出 35 4bp和 30 7bp的DNA片段 ,而对照菌株均呈阴性 ;自溶素及溶血素基因的扩增产物分别经限制性内切酶TthHB81和AccI消化后产生的片段和预期的完全一致 ;两对产物均可从 10fg的全细胞DNA中扩增出目的DNA片段。所建立的两套PCR系统对 2 8份临床标本分离物进行鉴定 ,其中PCR阳性的 15份分离物经生化学特性检查被鉴定为肺炎链球菌。本试验所建立的两套PCR检测系统具有特异性强 ,灵敏度高及操作简单等优点 ,均可用于肺炎链球菌的鉴定。     

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

SARS冠状病毒S基因序列克隆的构建

构建SARS冠状病毒S基因序列克隆p-SARS-S,作为自行设计、建立的RT-PCR检测方法的阳性对照,并为该基因的表达奠定基础.设计合成了位于病毒基因21 504～22 136位的长633 bp的序列片断作为模板进行PCR扩增;将PCR产物与T-Easy载体连接,经过转化提取重组质粒DNA.对构建的阳性克隆进行PCR、酶切、测序鉴定.对经EcoRⅠ酶切鉴定为阳性的重组表达质粒测序,结果显示插入片段大小、方向、碱基匹配与预期一致.构建的阳性对照克隆p-SARS-S有助于建立严格的SARS病毒基因室内质控措施.     

华中五味子AFLP反应体系的建立

目的：建立一个适于华中五味子研究用的AFLP反应体系。方法：以华中五味子硅胶干燥嫩叶为试材,采用改良CTAB法提取到高质量DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳对MseⅠ/EcoRⅠ双酶切、连接、预扩增和选择性扩增过程中的关键因素进行分析。结果：双酶切6h,片段主要集中在250～2000bp;连接产物和预扩增产物最适稀释倍数均为10倍;预扩增产物经选择性引物E-ACT/M-CAT和E-ACA/M-CAG扩增,琼脂糖电泳检测其主带分别集中在250～375bp和500～750bp,6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及银染,条带清晰可辨。结论：该体系具有稳定性高、重复性好等优点,可用于华中五味子AFLP分析。     

Leber氏病的PCR基因诊断

木文报告了用PCR技术对线拉体DNA突变引起的人类Leber氏病的研究。此病惠者的 mtDNA第11778位由G突变成A,这种点突变使sfaNI酶识别位点消失,因此可通过PC1t扩增此特 异片段确定其酶切多态性。我们扩增了含sfaN1酶切识别位点在内的一段340bp的mtDNA, sfaNI酶 将正常人的mtDNA切成190师和150bp两片段,而患者的mtDNA则保留完整的340bp, 关键词：线粒体DNA, PCR, Leber氏肩     

优化的反向PCR结合TAIL-PCR法克隆棉花线粒体atpA双拷贝基因及其侧翼序列

双拷贝基因及其侧翼序列的克隆是分子生物学中的一个难点。将优化的反向PCR(Inverse PCR,iPCR)与TAIL-PCR相结合,有效地克隆双拷贝基因及其侧翼序列。先用Southern blotting方法确定一种能获得合适长度片段的限制性内切酶,然后用优化的iPCR方法对该酶切产物进行自连和扩增,将2个拷贝的侧翼序列区分开。根据iPCR结果,进一步用TAIL-PCR扩增更远侧翼的序列。利用这套方法,获得了棉花可育胞质和不育胞质线粒体双拷贝atpA基因的所有EcoR I限制片段(2.2～5.1 kb)和HindⅢ限制片段(8.5～11.7 kb),克隆到2个拷贝各自的侧翼序列。研究结果说明,优化的iPCR与TAIL-PCR相结合是克隆双拷贝基因及其侧翼序列的一种高效方法。     

应用PCR方法检测油菜菌核病菌对多菌灵的抗药性

通过保守的寡核苷酸引物B1/B3扩增出油菜菌核病菌MBC^HR和MBC^S菌株的部分β-微管蛋白基因,结果发现编码的198位氨基酸由Clu(GAG)突变为Ala(GCG),表现高水平抗药性。根据MBC^HR菌株的突变设计2个快速检测方法：第一种方法是根据MBC^HR菌株197和198位密码子（GACGAG→GACGCG）形成HhaI酶切点（3'CGCG 5'）,将B1/B3的扩增产物874bp片段酶切成193bp和681bp片段,而MBC^S菌株的PCR产物不被酶切;第二种方法用198位突变密码子作为3'末端碱基设计2个等位基因特异性寡核苷酸引物（ASO）用一地“nested”PCR或直接从基因组DNA扩增。通过PCR扩增和ThaI酶切能直接检测油菜菌核病菌的MBC^HR和MBC^S菌株,所得结果与传统菌落直径法相吻合。