落叶松-杨栅锈菌基因组密码子使用偏好分析

为了解落叶松‐杨栅锈菌密码子使用模式,并探究影响其密码子偏好形成的因素,本研究利用CondonW对落叶松‐杨栅锈菌标准菌株98AG31基因组中14 650个基因进行分析,计算基因的有效密码子数,及64个密码子的相对使用度等偏好性参数。结果表明,落叶松‐杨栅锈菌全基因组水平的密码子偏好程度较低,只有少数基因呈现出高偏好性。落叶松‐杨栅锈菌的高频密码子多以A或T结尾,而最优密码子则倾向以G或C结尾。PR2-plot分析及ENC-plot曲线与中性绘图分析显示,落叶松‐杨栅锈菌基因密码子使用模式受到选择压力和突变压力等多重因素的影响,相较于选择压力,落叶松‐杨栅锈菌基因密码子的偏好更多地受到突变压力的影响。相关性分析表明,密码子碱基组成会对密码子偏好性产生影响,其他因素如序列长度等均不会影响密码子偏好性。     

香樟转录组基因密码子偏好性分析

为了解香樟基因密码子偏好性,该文以NCBI网站中香樟转录组数据为材料,利用生物信息学手段评价转录组数据质量,选取高质量数据的转录组,去除低质量序列,组装转录组,预测基因结构,再利用自编perl脚本提取以AUG开头的基因序列37 Mb序列34 931个基因,进一步利用CodonW分析基因密码子偏好性。结果表明:GC含量的变化范围为0.273～0.742,均值为0.452; ENC的范围为26.29～61.00,均值为52.76; CAI的范围为0.064～0.401,均值为0.199; RSCU值大于1的密码子数目为27个,其中以U或A结尾的有22个; 中性分析表明,小部分基因在对角线上,大多数基因偏离对角线; ENC-plot分析表明小部分基因在标准曲线上,大多数基因偏离标准曲线。上述研究结果表明,香樟基因的密码子偏好性比较弱,密码子常以A/U结尾; 突变和选择两者都在密码子偏好中起作用,而选择作用更大; 最终确定了GUU、CAG、GAA、UCU、GCU、GGU为最优密码子,通过对目标基因密码子的校正,提高表达效率,从而为利用基因工程技术改良香樟重要性状奠定了基础。     

沙枣叶绿体全基因组序列及其使用密码子偏性分析

该研究以2株野生沙枣(Elaeagnus angustifolia Linn.)嫩枝经温室水培后的嫩叶为材料,采用CTAB法分别提取总DNA,并利用第二代测序技术进行总DNA从头测序,组装后得到2株沙枣叶绿体基因组全序列,并详细分析了其蛋白质编码基因密码子使用的偏好性及其原因,为沙枣叶绿体基因工程和分子系统进化等研究奠定基础。结果显示:(1)组装得到沙枣叶绿体基因组序列全长150 546 bp,由长度为81 113 bp的长单拷贝(LSC)区域和25 494 bp的短单拷贝(SSC)区域,以及1对分隔开它们的长18 445 bp的反向重复序列(IRS)组成;注释共得到132个基因,包括86个蛋白编码基因、38个tRNA基因和8个rRNA基因。(2)沙枣叶绿体基因组蛋白编码基因密码子的第三位碱基GC含量(GC_3)为28.47%,明显低于整个叶绿体基因组GC含量(37%),也低于第一位(GC_1)和第二位(GC_2)碱基的GC含量,说明密码子对AT碱基结尾有偏好性;其中, UCU、CCU、UGU、GCU、CUU、GAU、UCA和UAA为最优密码子。(3)同义密码子相对使用频率(RSCU)分析发现,影响密码子使用模式的因素并不单一,密码子的偏好性受到突变、选择及其他因素的共同影响,并且自然选择表达引起的序列差异比突变对密码子偏好性的影响要显著;中性绘图分析、有效密码子数(ENC-plot)分析和奇偶偏好性(PR2-plot)分析表明,沙枣叶绿体基因组使用密码子的偏性受选择的影响更大。(4)通过最大似然法、最大简约法和贝叶斯方法对胡颓子科6个物种和1个枣的叶绿体基因序列构建系统发育树,与它们使用密码子偏性聚类的结果一致,表明叶绿体基因组使用密码子偏性与物种的亲缘关系相关。     

甘蔗ScMOC1基因启动子的克隆与瞬时表达分析

MOC1属于植物特有的GRAS家族蛋白基因,是调控植物腋芽形成发育的关键基因。启动子对基因转录效率起直接调控作用,其功能分析可以精确定位基因的表达部位、发育阶段和调控机制,克隆甘蔗腋芽形成发育关键基因ScMOC1的启动子序列,研究其功能对该基因表达调控机制具有重要意义。本研究以我国主栽甘蔗品种新台糖22号(ROC22)的基因组DNA为模板,通过基因组步移和巢式PCR技术克隆到ScMOC1起始密码子ATG上游1874 bp的启动子序列。PlantCARE在线分析预测表明,该序列包含多个真核生物启动子必需的核心元件TATA-box、CAAT-box以及与光响应、激素响应和分生组织表达等相关的顺式作用元件,推测ScMOC1启动子可通过激素诱导调控ScMOC1表达,且该启动子可能通过分生组织表达顺式调控元件CAT-box参与ScMOC1对甘蔗分蘖的调控。将获得的启动子序列替换pBI121质粒中的CaMV35S启动子驱动下游GUS基因表达进行活性分析,结果表明:本研究克隆的启动子片段能驱动GUS基因在甘蔗嫩叶中瞬时表达。5′缺失分析表明该启动子的基础启动子序列在起始密码子ATG上游350～500 bp之间。该结果为后续ScMOC1的调控机制研究奠定了良好的基础。     

巴西橡胶树 HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5’调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

鸟王茶基因密码子偏好性分析

生物体中普遍存在密码子使用偏好性,这对基因的异源表达效率具有较大影响.本研究使用CodonW软件对鸟王茶(Camellia sinensis var.niaowangensis)转录本中1 856个编码氨基酸的基因密码子进行分析,计算其密码子相对使用度,确定了27个最优密码子,并发现最优密码子大多以A或U结尾.通过ENC-GC3关联分析及PR2-plot偏倚分析,发现鸟王茶密码子使用模式受到突变和选择等多种因素的影响.与其他物种对比发现,鸟王茶密码子偏好性与其他物种存在不同程度的差异,其中与杨树及烟草差异最小.由于密码子具有通用性,分析结果对通过重建密码子提高茶树基因在其他植物中的表达效率从而验证鸟王茶基因功能具有一定意义.     

Kunitz蛋白酶抑制剂基因的密码子偏好性分析

目的:分析豆科植物的Kunitz蛋白酶抑制剂(KTI)基因密码子偏好性,确定最适模式植物与外源表达系统。方法:运用Codon W等程序分析密码子偏好性,并用决明KTI基因验证分析结果的可信度。通过聚类分析,确定研究KTI基因功能的最适模式植物,比较决明KTI基因与酵母和大肠杆菌的基因组密码子偏好性,选择最优外源表达系统。结果:KTI基因对以A或U结尾的密码子偏好性强。豆科与茄科植物聚为一簇,表明烟草是研究KTI基因功能的最适模式植物。决明KTI基因和大肠杆菌、酵母基因组对比,有较大密码子使用频率差异的各有28、24个,表明酵母是最优外源表达系统。结论:确定研究KTI基因功能的最佳模式植物是烟草,酵母是最优外源表达系统,对基因改良与育种具有指导意义。     

甘蓝型油菜WRKY基因家族碱基组成及密码子使用特性分析

WRKY转录因子广泛地参与植物的抗逆防卫反应。通过对甘蓝型油菜WRKY基因家族碱基组成和密码子用法的分析,发现其碱基组成不仅对密码子的偏好性选择有重要影响,而且与基因的表达水平参数(Nc、CAI、CBI等)显著相关。通过对密码子RSCU值的分析,得到了TTA、CTT、AGA等29个偏好密码子,且多以碱基A或T结尾。ENc-plot分析表明,除了碱基组成之外,自然选择等其它因素对密码子偏好性也有影响。     

巴西橡胶树HbNTL1基因启动子的克隆与序列分析

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子HbNTL1基因cDNA序列,利用基因组步移的方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbNTL1基因上游1 718 bp的调控片段。序列分析表明,该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点A位于起始密码子上游206 bp处。该启动子序列除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在赤霉素、茉莉酸和脱落酸等激素响应元件以及大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box和MYCCONSENSUSATHSE等反应元件,表明HbNTL1转录因子可能是一个逆境胁迫相关NAC转录因子,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。     

水稻胁迫相关基因OsPM1启动子的克隆与分析

依据NCBI数据库OsPM1的序列信息,采用PCR技术扩增获取OsPM1的2 100bp的启动子序列。利用PLACE预测启动子的顺式作用元件分析表明,启动子内含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,主要有ABA响应相关元件、脱水响应元件、低温响应元件、热激响应元件和转录因子结合元件。构建OsPM1的启动子和GUS基因融合表达载体,转入拟南芥。组织化学染色分析结果显示,非生物胁迫处理前,幼苗中GUS基因表达水平很低;干旱、低温、高盐等胁迫处理后,GUS基因表达量显著升高。研究表明,OsPM1的启动子能够显著提高在干旱、高盐和低温处理后下游基因的表达水平。     

金针菇分子生物学和功能基因研究进展

金针菇是重要的食药用菌,具有很高的经济价值。随着金针菇全基因组序列的公布、多组学分析、转基因技术、基因编辑技术的发展,越来越多的研究者开始关注金针菇重要性状(如生长速度、菌柄长度、生物活性物质含量等)相关的分子调控机制以及关键基因的发掘。本文综述了分子生物学技术在金针菇研究中的应用并分析了不同技术的利弊;同时,系统介绍了金针菇菌丝和子实体生长发育、温度应答、生物活性物质代谢、蓝光响应等重要生物学过程中调控基因的最新研究进展,并对未来金针菇分子生物学研究的方向进行了展望,旨在为我国金针菇产业的发展提供有价值的参考。     

金针菇菌柄发育的转录组与蛋白组分析

菌柄是金针菇等食用菌的主要商品部位,但其生长机制仍不明确。本研究对金针菇伸长期和成熟期菌柄进行了转录组联合蛋白组分析,结果显示,两样本显著性差异表达基因和蛋白分别为721个和61个,均以上调表达为主。GO（gene ontology）功能聚类分析表明：有72.41%的差异表达基因富集在催化活性（catalytic activity）条目下。细胞组分（cell part）和绑定结合（binding）条目同时富集了较多的差异表达基因和蛋白。KEGG通路富集分析显示：碳水化合物代谢通路（carbohydrate metabolism）和氨基酸代谢通路（amino acid metabolism）富集的差异表达基因较多。差异表达蛋白富集较多的通路是单环菌素生物合成（monobactam biosynthesis,ko00261）、链霉素生物合成（streptomycin biosynthesis,ko00521）和有机含硒化合物代谢（selenocompound metabolism,ko00450）等。内质网蛋白质加工（protein processing in endoplasmic reticulum,ko04141）和MAPK信号通路（MAPK signaling pathway-yeast,ko04011）在转录组和蛋白组的KEGG富集分析中均为差异通路。本研究联合转录组和蛋白组数据筛选了40个金针菇菌柄发育中差异表达基因,为深入研究揭示食用菌菌柄发育过程提供候选基因。     

金针菇CA基因家族分析及其对CO2的响应

金针菇栽培通过提高栽培室CO₂浓度来抑制菌盖生长,提高商品质量。碳酸酐酶能调节CO₂/HCO₃ ^-在细胞内的平衡,它可能是响应CO₂胁迫的关键酶。本研究利用我们已完成的金针菇Flammulina filiformis的基因组测序数据,以双色蜡蘑碳酸酐酶家族基因为参照,通过本地BLAST,得到7个金针菇碳酸酐酶家族的基因,分别命名为CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、CA-6、CA-7。基因结构、保守结构域和系统进化分析结果均支持这7个序列是碳酸酐酶家族的编码基因。高浓度CO₂胁迫处理金针菇子实体12h,CA-1、CA-2表达量与CO₂浓度正相关,CA-5负相关,CA-3、CA-4和CA-6没有响应,CA-7无明显规律。据此推测,CA-1、CA-2和CA-5可能是金针菇响应CO₂胁迫的关键基因之一,参与调控菌盖生长发育。     

圆红冬孢酵母的密码子用法分析

运用CodonW等软件,分析了圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides基因组中191个蛋白质编码基因的密码子使用模式,包括密码子3个位置上的GC含量、有效密码子数和密码子使用频率。圆红冬孢酵母有效密码子数ENc值为38.9,密码子GC含量为63%,密码子第三位GC含量为78.3%,且偏好使用G或C结尾的密码子,确定了圆红冬孢酵母R. toruloides的21个高表达优越密码子。研究发现,圆红冬孢酵母与毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌和拟南芥在密码子使用频率上有较大差异,而与解脂耶氏酵母和果蝇差异相对较小。研究结果对提高外源基因在圆红冬孢酵母中表达效率及相关代谢工程和合成生物学研究有一定意义。     

极小种群濒危植物广西火桐、丹霞梧桐的叶绿体基因组特征

广西火桐(Firmiana kwangsiensis)和丹霞梧桐(F. danxiaensis)是我国南方特有物种, 其分布范围狭窄, 种群数量少。为了解其叶绿体基因组结构及系统发生关系, 本文通过高通量测序方法获得广西火桐和丹霞梧桐的浅层基因组数据, 通过生物信息学方法对叶绿体全基因组进行组装, 并对其结构特征进行分析。结果表明: 广西火桐和丹霞梧桐的叶绿体基因组大小分别为160,836 bp和161,253 bp, 具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构, 包含长度分别为89,700 bp、90,142 bp的大单拷贝区(large single copy, LSC), 长度分别为19,970 bp、20,067 bp的小单拷贝区(small single copy, SSC)及长度分别为25,583 bp、25,522 bp的2个反向重复序列区(inverted repeat sequence, IR)。两个物种的叶绿体基因组共注释得到131个基因, 包括86个蛋白编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因。广西火桐的叶绿体基因组中共检测出26个正向重复序列、2个反向重复序列、21个回文重复序列、21个串联重复序列和98个简单重复序列; 丹霞梧桐叶绿体基因组中共检测出23个正向重复序列、5个反向重复序列、21个回文重复序列、30个串联重复序列和107个简单重复序列。系统发生分析结果表明5种梧桐属(Firmiana)植物构成两个强烈支持的分支(支持率100%), 一个分支为广西火桐、美丽火桐(F. pulcherrima)和火桐(F. colorata), 其中广西火桐与美丽火桐构成姐妹群; 另一分支是互为姐妹群的丹霞梧桐和云南梧桐(F. major)。综上所述, 广西火桐和丹霞梧桐的叶绿体基因组结构、基因排列及重复序列具有较高的相似性, 系统进化树将5种梧桐属物种分为两个分支, 其中广西火桐和美丽火桐最近; 而丹霞梧桐与云南梧桐关系最近。本研究鉴定的SSR位点可为梧桐属物种系统发生、进化关系的研究提供遗传信息。     

金针菇光受体隐花色素Ffcry基因的鉴定及其表达模式

光照对金针菇生长发育及形态建成有重要作用。光受体隐花色素(cryptochrome)是响应光信号的主要受体之一。本研究首先鉴定了黄色金针菇FL19隐花色素基因Ffcry的基因和蛋白结构,并对其启动子中的顺式作用元件进行预测,其中包含有3个光响应元件。进一步对Ffcry基因在不同光照条件下的表达模式进行了系统研究,结果显示Ffcry基因在蓝光下表达量显著高于黑暗以及其他波长的光照条件;蓝光强度则在光通量为10 μmol/(m²·s)时Ffcry表达量最高,且Ffcry在蓝光照射20 min后逐渐上调表达,在180 min后表达量趋于稳定。最后,检测金针菇子实体不同发育时期发现,Ffcry基因在幼菇期菌盖中表达量最高,其次是伸长期菌盖和成熟期菌盖。该研究为后续研究隐花色素的分子功能以及深入揭示金针菇的光形态建成奠定了基础。     

金针菇细胞色素c过氧化物酶基因（ffccp）及其在菌柄伸长的差异表达初步分析

细胞色素c过氧化物酶（cytochrome C peroxidase,CcP）是细胞内H₂O₂的主要降解酶,参与真菌的氧化应答过程。本研究基于基因组数据获得一个金针菇细胞色素c过氧化物酶编码基因,命名为ffccp。该基因全长1 913bp,包含一个1 098bp的完整开放阅读框,编码365个氨基酸。生物信息学分析结果显示,该基因编码的蛋白质（FfCcP）无跨膜结构和信号肽,不形成二硫键结构,亚细胞定位于线粒体上,具备血红素结合蛋白的保守位点。序列比对和进化分析结果显示,金针菇与糙皮侧耳Pleurotus ostreatus等大型真菌的CcP序列高度相似（相似度均超过70%）,属于CcP家族蛋白。RT-qPCR的检测结果显示,氧化胁迫和损伤胁迫均能诱导ffccp基因上调表达,但两种胁迫对ffccp表达的调控机制可能并不相同。进一步检测ffccp在子实体发育过程中的差异表达情况,发现ffccp在伸长期菌柄出现显著上调表达,且表达量与菌柄伸长速度的相关性达到0.998,为极强正相关。推测ffccp的上调表达可能有利于菌柄的伸长。     

基于重测序信息的金针菇菌株资源遗传多样性及群体结构分析

通过对来自国内外的28份金针菇菌株资源的重测序共计检测到SNP位点1 241 583个,InDel位点623 670个。通过筛选分型,1 474个高质量SNP标记（多态信息含量指数PIC介于0.101-0.966之间）被用于金针菇资源群体多样性和结构分析。经计算,菌株间遗传距离在0.057-0.631之间。UPGMA进化树拓扑结构显示栽培菌株是其与野生菌株混合分支的一个亚支,自然栽培和工厂化栽培菌株可各自聚成一支,符合金针菇育种历史。群体结构结果显示金针菇种质资源包含5个亚群。主成分分析显示菌株在二主分之间的位置及互相间距离基本符合进化树分类、群体结构和遗传距离。本研究为金针菇分子标记和基因型的确定提供序列基础,也为后续资源保护利用、重要农艺性状的基因定位和基于分子标记的聚合育种提供理论依据。     

一株内生砖红镰刀菌促进烟草生长和增强青枯病抗性

课题组前期报道了一株对马铃薯具有促生防病作用的内生砖红镰刀菌Fusarium lateritium (FL617)。为拓展该菌株的应用范围,本研究以同为茄科作物的烟草为研究对象,探究了砖红镰刀菌对其生长和抗病的影响。结果表明,与对照组相比,处理组叶表面积、主根数、叶片数、叶绿素a和叶绿素b含量分别提高了5.0、3.9、1.4、1.3和1.3倍;该结果表明砖红镰刀菌对烟草具有促生作用。生测结果表明,砖红镰刀菌增强了烟草对青枯病的抗病性,其青枯病病情指数下降约30%。植物激素合成相关基因表达模式分析,发现处理组植物激素合成相关基因表达显著上调(1.6-39.9倍);用青枯病菌Ralstonia solanacearum感染寄主植物后分析其水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)和R基因信号相关基因的转录模式,发现与对照组相比,处理组SA、JA相关基因均显著上调(1.2-8.3倍),仅有一个R基因显著下调(50%)。进一步用GFP标记的菌株进行荧光定殖观察,发现植物根系周围簇生着带有绿色荧光信号的真菌菌丝,表明砖红镰刀菌可以定殖于烟草根系。综上所述,推测砖红镰刀菌F. lateritium能够通过定殖于烟草根系介导植物激素、免疫防御相关基因的表达从而影响植株的生长发育和抗病性。