灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

小鼠IL-35基因毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的构建真核酵母表达载体pPIC9K与小鼠IL-35基因的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,在毕赤酵母GS115菌株中诱导表达,并对其进行鉴定。方法以pET-30a-mIL-35为模板,用PCR扩增出IL-35去信号肽基因全序列,并在3'端引入His标签,构建重组质粒pPIC9K-mIL-35-His,经SalⅠ线性化重组质粒后,用电穿孔方法将该基因转染毕赤酵母细胞内。经G418梯度筛选高拷贝转化子,筛选Mut+表型后经PCR进一步鉴定IL-35基因与酵母染色体是否整合。小量诱导表达筛选出高表达菌株,大量甲醇诱导表达,以SDS-PAGE及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。结果小鼠IL-35基因真核酵母表达载体pPIC9K-mIL-35-His构建成功,并且在GS115中通过甲醇诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot分析,可见相对分子质量约为65 000的目的蛋白。结论实验所构建的重组质粒pPIC9K-mIL-35-His可在毕赤酵母GS115中正确的表达小鼠IL-35基因。     

禽流感病毒H5HA、H7HA、H9HA亚型血凝素基因在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统进行了禽流感病毒H5HA、H7HA及H9HA亚型血凝素基因的真核表达研究。首先将H5HA、H7HA及H9HA基因片段分别插入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-H5HA、pPIC9K-H7HA和pPIC9K-H9HA;再将所获重组质粒分别经SacⅠ、BglⅡ及SalⅠ线性化后,电转化GS115感受态细胞,以插入/替换的方式进行重组,并经MD平板与MM平板筛选,及PCR鉴定,得到重组酵母工程菌GS115/pPIC9K-H5HA、GS115/pPIC9K-H7HA及GS115/pPIC9K-H9HA;用甲醇诱导分泌表达目标蛋白。经SDS-PAGE和Western-blotting检测,结果表明,H5HA、H7HA及H9HA蛋白在毕赤酵母中均获得表达。酵母表达了上述目的蛋白,可直接进行抗原检测,并可用于抗体检测试剂盒及亚单位疫苗制备的辅助研究。     

α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）基因序列,通过PCR从枯草杆菌168基因组上扩增得到编码ALDC的结构基因。将该基因克隆到大肠杆菌一毕赤酵母穿梭载体pPIC9中,构建了重组质粒pPIC9-ALDC,电击转化毕赤酵母GS115。在甲醇诱导下,毕赤酵母分泌表达了ALDC。SDS—PAGE分析可见到Mr约62000的表达条带,经测定,表达产物活力为0．03U／mL。     

合成耐高温α-淀粉酶PFA在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220U／L。     

人白介素2受体γ链胞外区在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的:在毕赤酵母GS115中表达重组人白细胞介素2受体γ链(rhsIL-2Rγ)胞外区。方法:用RT-PCR法从正常人淋巴细胞中获得IL-2Rγ胞外区基因;构建重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ,用聚乙二醇法转入感受态GS115菌株,MD平板筛选His+转化子,用BMMY培养基诱导表达rhsIL-2Rγ;对重组蛋白进行免疫酶染色、SDS-PAGE及Western印迹鉴定。结果:克隆到目的片段,构建了重组质粒pPIC9K-hsIL-2Rγ;免疫酶染色、Western印迹等结果显示,重组质粒已成功转化GS115,并获得诱导表达的rhsIL-2Rγ。结论:在毕赤酵母GS115中表达了rhsIL-2Rγ,其蛋白条带有上移现象,分子较大,可能其糖基化过度或存在二聚体。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据质粒pPIC9K中信号肽基因和质粒pPIC3.5K/hTα1-RP,构建表达质粒pPIC9K/S-hTα1-RP,通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达。     

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因（cGH）的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH的毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。     

人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：对人源抗狂犬病毒糖蛋白（GPRV）单链二硫键稳定抗体（ScdsFv）进行精氨酸密码子修饰,实现其在酵母中的分泌表达,并检测其生物学活性。方法：参照巴斯德毕赤酵母偏好密码子,对抗GPRV ScdsFv原核表达基因进行密码子修饰,并通过点基因融合技术构建ScdsFv重组酵母表达基因,连接pPIC9K构建重组表达质粒pPIC9K-ScdsFv,电转化毕赤酵母GS115,经筛选后进行甲醇诱导表达。结果：SDS-PAGE及Western blot检测到重组表达质粒在30℃经甲醇诱导表达的蛋白相对分子质量为30000;荧光抗体试验验证ScdsFv能靶向结合GPRV;MTT试验说明ScdsFv能中和狂犬病毒,具有一定的细胞保护作用。结论：重组ScdsFv在酵母系统中可以有效表达。具有较好的生物学活性。     

人白介素12亚基p40和p35基因串联在毕赤酵母中的表达及表达产物活性分析

摘 要 利用毕赤酵母系统表达有活性的人单链白细胞介素12（hscIL-12）,PCR法从质粒pBI121-IL-12中扩增hscIL-12基因,经酶切、连接构建重组表达载体pPIC9K-hscIL-12,SacI线性化后,PEG1000法转化毕赤酵母GS115,经G418筛选和菌落PCR鉴定,经甲醇诱导,hscIL-12在酵母中获得分泌表达,表达产物经Western Blot检测,显示该蛋白相对分子质量为70KDa,可与鼠抗人IL-12单克隆抗体特异性结合;定量分析结果表明,重组酵母培养上清中hscIL-12约占总蛋白的26％,表达量约为60mg／L;生物学活性实验表明,重组蛋白能促进人外周血淋巴细胞增殖。为利用rhscIL-12进行基因治疗奠定了基础。     

人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达有降糖活性的人胰高血糖素样肽-1（hGLP-1）突变体（2Gly-hGLP-1）与人血清白蛋白（HSA）的融合蛋白。方法：为将GLP-1氨基酸序列第2位的丙氨酸（Ala）定点突变为甘氨酸（Gly）,根据毕赤酵母偏爱密码子合成编码2Gly-hGLP-1的基因;采用重叠PCR法拼接2Gly-hGLP-1和HSA的基因,使得2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽接头连接;将该融合基因插入表达载体pPIC9构建为重组载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA,电击转化至毕赤酵母GS115细胞,通过表型筛选和诱导表达实验获得高效表达菌株;工程菌在5L发酵罐中培养后,对发酵产物进行分离纯化和生物学活性分析。结果：融合蛋白在5L发酵罐中的表达量约为200mg/L,经纯化后纯度可达95%以上;小鼠糖耐量实验表明该融合蛋白具有明显的控血糖活性。结论：在毕赤酵母中分泌表达的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有降血糖活性。     

人血清白蛋白和粒细胞集落刺激因子融合蛋白的克隆表达

构建重组人血清白蛋白粒细胞集落刺激因子（HSA-hG-CSF）表达载体,用毕赤酵母表达该重组蛋白。PCR扩增出人血清白蛋白基因（HSA）和粒细胞集落刺激因子基因（hG-CSF）,GGGGS作为小肽接头,采用重叠PCR的方法将HSA和hG-CSF拼接起来,与质粒载体pPIC9K连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α。抽提质粒,用SalI酶切重组质粒,电转化法导入毕赤酵母SMD1168中,通过表型筛选和诱导表达实验得到蛋白表达工程菌。Western-blotting分析表明融合蛋白具有粒细胞集落刺激因子免疫原性。NFS-60细胞测活实验分析表明体外活性达到约4.0×10^7IU/mg。     

解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5在毕赤酵母中的异源表达及酶学性质

【目的】克隆解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)脂肪酶LIP4和LIP5的cDNA序列,研究其基因结构,并实现其在毕赤酵母中的功能表达,以探讨其酶学性质。【方法】利用反转录PCR首次扩增LIP4和LIP5的编码基因,用SignalP 3.0分析其基因序列,然后分别构建胞内表达载体pPIC3.5K-Lip4、pPIC3.5K-Lip5和胞外表达载体pPIC9K-Lip4、pPIC9K-Lip5,将其转入毕赤酵母GS115中表达,以NTA树脂纯化酶蛋白,研究其酶学性质。【结果】cDNA序列测序结果显示两者均不含内含子,酶蛋白的氨基酸序列中含有典型脂肪酶的活性三联体结构和五肽保守区;酶学性质研究表明,两者的最适底物均为癸酸(C8)对硝基苯酚酯,最适pH为7.0,最适温度为40℃,但LIP4对pH和温度更敏感;两者均能被Ca2+激活,且LIP5还能为Mg2+激活,但均被Hg2+、乙二胺四乙酸(EDTA)和苯甲基磺酰氟(PMSF)强烈抑制。【结论】首次克隆了解脂耶氏酵母脂肪酶LIP4和LIP5编码基因,实现了其在毕赤酵母中的活性表达,并初步研究了其酶学性质,为上述脂肪酶的应用及进一步深入研究解脂耶氏酵母脂肪酶家族奠定了基础。     

巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因GR1的分离克隆与鉴定

目的：分离克隆并鉴定巴斯德毕赤酵母表达系统中甘油阻遏相关基因。方法：PCR扩增LacZ基因,克隆至pPLC9载体,构建pPIC9-LacZ表达载体,经Sal I线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,构建GS115-LacZ模式菌株;用限制酶介导整合（REMI）技术使GS115-LacZ菌体基因组产生随机突变,筛选甘油去阻遏的GS115-LacZ△菌体;Southern blot鉴定GS115-LacZ△基因组,用质粒拯救技术和TAIL-PCR克隆未知基因序列并测序。结果：得到甘油去阻遏的GS115-LacZ△菌体,经Southern blot分析,突变仅发生在1个基因中;通过质粒拯救和TAIL-PCR,分离得到阻遏相关基因GR1,共2863bp,经在线BLAST,发现其编码一种过氧化物酶体自吞噬相关蛋白。结论：分离得到阻遏相关基因GR1,与过氧化物酶体自吞噬相关,提示过氧化物酶体自吞噬相关基因可能对醇氧化酶启动子AOX1的转录活性有影响。     

突变型人白细胞介素-2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

为了提高人重组白细胞介素 2的稳定性和活性以及减少毒副作用 ,有必要定向改造rhIL 2的分子结构 .用PCR法从白细胞介素 2 (IL 2 )cDNA全序列中扩增成熟的肽基因片段 ,并利用定点突变技术将人重组白细胞介素 2第 12 5位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列 .编码 18位亮氨酸的序列突变为蛋氨酸序列 ;编码 19位亮氨酸的序列突变为丝氨酸序列 .突变型人白细胞介素 2 (MvIL 2 )基因与表达载体pPIC9K重组 ,酶切线性化后用Invitrogen转化毕赤酵母试剂盒导入酵母细胞进行整合 ,经筛选得到一高表达白介素 2的克隆 .SDS PAGE显示 ,表达量约占总量的4 5 7% .经Western印迹验证 ,重组人白介素 2有免疫活性 ;与野生型IL 2相比 ,所获得的突变型IL 2纯品的比活性为 4 0× 10 7IU mg蛋白 ,比天然型IL 2高 4～ 5倍     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。