用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

艾迪注射液联合化疗对卵巢癌患者血清HE4，CA125，CA19-9，AFP，CEA水平及T细胞亚群的影响

目的:探讨艾迪注射液联合化疗对卵巢癌患者血清人附睾蛋白4(HE4)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原19-9(CA19-9)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)及T细胞亚群的影响。方法:选取我院2014年8月至2016年2月收治的78例卵巢癌患者,按照随机数表法将其分为观察组(n=39)和对照组(n=39),对照组患者给予化疗,观察组患者给予艾迪注射液联合化疗,比较两组患者的临床疗效、治疗前后血清HE4、CA125、CA19-9、AFP、CEA水平及T细胞亚群的变化。结果:治疗后,观察组的总有效率(94.87%)显著高于对照组(76.92%)(P0.05)。治疗后,两组患者血清HE4、CA125、CA19-9、AFP、CEA水平均较治疗前明显下降,且观察组显著低于对照组(P0.05)。治疗后,两组患者CD3~+、CD4~+、CD8~+较治疗前均显著降低,且观察组患者CD3~+、CD4~+、CD8~+低于对照组(P0.05)。结论:艾迪注射液联合化疗对卵巢癌治疗效果显著,能有效降低血清HE4、CA125、CA19-9、AFP、CEA水平并改善患者免疫功能。     

用毕赤酵母的GAP启动子调控表达L-阿拉伯糖异构酶

应用PCR从大肠杆菌基因组中扩增L-阿拉伯糖异构酶基因,用EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体,获得重组表达载体pGAP9K-L-ai。通过电转法将pGAP9K—L-ai转化毕赤酵母GS115,筛选高G418抗性和高表达L-阿拉伯糖异构酶的重组工程菌。用葡萄糖作为碳源在摇瓶中发酵48 h,表达重组L-ai 53 mg/L。用毕赤酵母的GAP启动子调控表达的重组L-ai具有异构D-半乳糖生成D-塔格糖的生物学活性。     

应用分子生物学方法检测宫颈液基细胞残液中HPV16／18感染的对比研究

对比免疫蛋白印迹及斑点杂交检测人乳头瘤病毒HPV16/18的检出率,以期找到子宫颈癌早期筛查的最佳方法。采用免疫蛋白印迹与斑点杂交分别对173份宫颈液基细胞进行HPV16/18检测。150例经宫颈液基细胞学镜下筛查为宫颈上皮内病变及宫颈癌的患者,其中免疫蛋白印迹对低度病变检出率为47.6%(30/63),对高度病变检出率为57.9%(33/57),对浸润癌的检出率为86.7%(26/30),其中鳞癌为85%(17/20),腺癌为90%(9/10),采用斑点杂交对低度病变检出率为28.6%(18/63),对高度病变检出率为42.1%(24/57),浸润癌的检出率为80%(24/30),其中鳞癌为75%(15/20),腺癌为90%(9/10)。采用免疫蛋白印迹对23例正常对照的细胞HPV检出率为13.1%(3/23),斑点杂交的检出率为8.7%(2/23)。各级宫颈病变中HPV16/18的检出率均较对照组差异有统计学意义(P<0.05)。免疫蛋白印迹检测HPV16/18比斑点杂交的检出率要高,为发现HPV一过性携带者,达到早期诊断的目的。     

Ucf-101对大鼠局灶性脑缺血再灌注后Caspase-3蛋白表达的影响

目的观察Ucf—101对大鼠脑缺血再灌注后神经元caspase-3蛋白表达及细胞凋亡的影响,研究其对缺血性脑损伤是否具有保护作用。方法将36只雄性WiStar大鼠随机分为3组：假手术组、缺血组及Ucf—101组,采用线栓法建立大鼠右侧大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）2h再灌注模型,于再灌注后6h和24h断头取脑,采用TTC法测梗死体积,TUNEL法原位标记DNA片段,检测TUNEL阳性细胞的变化,免疫组化法观察脑皮质神经元caspase-3的表达。结果脑缺血再灌注后不同时间点（6h、24h）,Ucf-101组与缺血组相比梗死体积明显缩小,有显著性差异（P〈0．05）;假手术组未见梗死现象。缺血组TUNEL阳性细胞数较假手术组明显增多（P〈0．05）,脑皮质caspase-3的表达较假手术组亦显著增强（P〈0．05）,给予Ucf-101处理后,TUNEL阳性细胞数较缺血组明显减少（P〈0．05）,caspase-3的表达较缺血组亦明显减弱（P〈0．05）。结论Ucf-101能有效地抑制脑缺血再灌注损伤,下调脑皮质神经元Caspase-3蛋白的表达,抑制神经元的凋亡,发挥神经保护作用。     

宫颈脱落细胞中HCCR的表达及意义

目的研究人宫颈癌基因(HCCR)在宫颈脱落细胞中的表达情况,探讨其对宫颈癌及癌前病变诊断的意义。方法采用Western blot及免疫组化SP法对79例宫颈脱落细胞中HCCR蛋白进行检测,其中正常宫颈上皮脱落细胞11例、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)53例、宫颈癌(CCa)15例。所有标本均来自中国医科大学附属第一医院。结果HCCR基因在正常宫颈脱落细胞中不表达或阳性率较低,在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中表达阳性率随病变加重而逐级升高。结论HCCR与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发生密切相关,检测宫颈脱落细胞中HCCR蛋白的水平对宫颈癌的筛查和诊断可能具有重要意义。     

信号识别颗粒调控蛋白转运系统

蛋白质是一类重要的生物大分子。在蛋白质转运系统中,很多蛋白质在核糖体中合成,然后通过内质网或质膜的转运到达相应的细胞器发挥生物学功能。蛋白质的分泌表达途径总共分为三类,分别为Sec分泌途径、双精氨酸途径和信号识别颗粒转运系统。本文简要介绍蛋白质的基本转运途径,主要介绍由信号识别颗粒所介导的蛋白质转运。分别概述信号识别颗粒及其受体的组成与功能,并对其调控途径做简要的介绍;同时也简单介绍与其相关的Yid C膜蛋白家族;对信号识别颗粒蛋白调控系统存在的必需性提出新的见解。     

溶酶体相关细胞器生物发生复合体相互作用组构成胞内体运输网络

随着高等生物中十几个新的参与囊泡运输的 Hermansky-Pudlak 综合征(HPS)蛋白质的发现, 认为可能存在一类新的囊泡运输通路。该通路主要由新近鉴定的 3 个被称为溶酶体相关细胞器生物发生复合体(BLOC)所组成, 被分别命名为BLOC-1、BLOC-2 和 BLOC-3。越来越多的证据表明这些复合体与以前认识较清楚的 AP3 和 HOPS 复合体共同在胞内体运输中起重要作用。这些复合体之间的相互作用构成了以胞内体和细胞骨架为连接纽带的参与蛋白质运输的复杂网络。该网络中的每个节点的相互作用可区分为复合体内和复合体外相互作用两大类。复合体之间的联系可以是来自不同复合体亚基间的直接相互作用, 也可以通过耦联的节点联结不同的复合体。解析这一复杂网络有助于进一步了解参与蛋白质和膜运输这一动态而精细网络的结构与功能。一旦该网络结构得到破坏, 则可能导致如 HPS 这类囊泡运输或细胞器发生障碍性疾病。     

免疫印记法检测宫颈脱落细胞中HPV16/18 E6蛋白的意义

目的用免疫印记法检测宫颈脱落细胞中人乳头瘤病毒（HPV）16/18型E6蛋白的表达,从而为探求一种简捷、无创的诊断宫颈癌及其癌前病变的新方法提供理论依据。方法采用免疫印记法（Western blot）检测112例宫颈脱落细胞标本中HPV16/18 E6蛋白的表达,并以导流杂交检测标本中HPV DNA作为对照。结果在宫颈癌组和CINII/Ⅲ组,HPV16/18 E6蛋白的表达水平（75%、67.5%）明显高于正常对照组（5%）,P（0.05;而CINI组（31.5%）与正常对照组比较,HPV16/18 E6蛋白表达的差异无统计学意义,P=0.05。结论宫颈脱落细胞中HPV16/18 E6蛋白的过度表达与宫颈癌及CINII/Ⅲ的发生密切相关;利用免疫印记法检测脱落细胞中HPV16/18 E6蛋白对宫颈鳞癌及CINII/Ⅲ的诊断及无创性筛查具有重大意义。     

HIF-1α在宫颈癌和宫颈上皮内瘤变中的表达及意义

为了探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达及生物学意义,利用免疫组织化学、Western blot和RT-PCR等方法检测了宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、癌旁组织、正常组织和液基细胞中的HIF-1α的表达水平.研究结果表明,宫颈癌、CIN Ⅱ-Ⅲ、CIN Ⅰ和正常组织中HIF-1α的阳性表达率分别为58.9%(46/78)、48.0%(12/25)、6.67%(1/15)、0(0/12);宫颈癌组织中,HIF-1α表达与肿块大小、FIGO分期、组织学分级和淋巴结转移密切相关.与患者年龄无关;宫颈癌组织和CIN Ⅱ-Ⅲ中的mRNA和蛋白水平均高于癌旁和正常组织及CIN Ⅰ;液基细胞中宫颈癌和HSIL的mRNA和蛋白水平都高于LSIL及正常细胞.HIF-1α可能是宫颈癌形成过程中的早期分子事件,其表达增强与宫颈癌的浸润性发展密切相关,有可能成为新的早期筛查和判断宫颈癌生物学行为的诊断指标.