含有禽网状内皮组织增生病病毒基因组片段的天然重组禽痘病毒的研究

将国内5个不同生产厂家来源的禽痘弱毒疫苗株和1株禽痘野毒株在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传5代,用禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)特异性的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(Immunonuoreseellee assay,IFA),均检测不到传染性REV。但以6株禽痘病毒(FPV)感染的第2代和第5代细胞基因组提取物为模板,通过PCR均能扩增出REV的长末端重复序列(LTR)和囊膜蛋白(env)基因片段。用特异性核酸探针作分子斑点杂交(Dot blot),结果显示所扩增的PCR条带为特异的REV—LTR和REV—env)基因片段。实验结果表明,国内的一些痘病毒疫苗和野毒株基因组中,已稳定地整合进了REV的基因组成分。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提 ,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒 (ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上 ,构建了含有ILTVgB基因和新城疫病毒 (NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F ,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维 (CEF)细胞后 ,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒 (rFPV-gB-F) ,并进行了 6轮蚀斑纯化。Western blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTVgB基因和NDVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上,构建了含有ILTV gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维(CEF)细胞后,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒(rFPv-gB-F),并进行了6轮蚀斑纯化。Western-blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTV gB基因和NBVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

昆虫细胞表达的网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白及其免疫性

利用Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystems构建了能表达禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)囊膜糖蛋白基因(env)的重组杆状病毒。用REV特异性单克隆抗体分别做间接免疫荧光抗体试验(IFA)和免疫转印试验,均可从感染的Sf9昆虫细胞中检出REVenv。重组杆状病毒感染的Sf9细胞裂解后制备成油乳疫苗免疫SPF鸡后,可以诱发维持45d以上的特异性抗REV抗体,并可抵抗REV病毒感染。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30-gp90串联表达蛋白及其免疫原性

【目的】研究禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus,REV)群特异性抗原P30与囊膜糖蛋白gp90体外共表达蛋白的免疫原性,为研发新型REV抗体诊断试剂盒提供基础。【方法】根据REV脾脏坏死病毒(spleen necrosis virus,SNV)株的前病毒基因组cDNA序列,设计合成2对引物,以pPB101质粒为模板,分别扩增REV p30基因和gp90基因片段。将PCR产物依次克隆入表达载体pET-28a(+)中,通过酶切鉴定和测序分析,筛选阳性重组克隆pET-p30-gp90。重组菌经异丙基硫代D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western blot检测表达蛋白与特异性血清之间的反应性。制备表达蛋白的抗血清,以该抗血清与REV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光实验(IFA),验证表达蛋白的免疫原性。【结果】经SDS-PAGE电泳后能观察到预期大小的表达条带,Western blot结果显示,重组蛋白能与REV抗血清反应。将表达产物纯化后免疫Balb/c小鼠,制备p30-gp90抗血清,该抗血清与REV感染CEF在IFA中呈现特异性荧光反应。【结论】体外串联表达REV p30-gp90蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30-gp90串联表达蛋白及其免疫原性

摘要:【目的】研究禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis Virus,REV)群特异性抗原P30与囊膜糖蛋白gp90体外共表达蛋白的免疫原性,为研发新型REV 抗体诊断试剂盒提供基础。【方法】根据REV脾脏坏死病毒(spleen necrosis virus,SNV)株的前病毒基因组cDNA序列,设计合成2对引物,以pPB101质粒为模板,分别扩增REV p30基因和gp90基因片段。将PCR产物依次克隆入表达载体pET-28a(+)中,通过酶切鉴定和测序分析,筛选阳性重组克隆pET-p30-gp90。重组菌经异丙基硫代D-半乳糖苷( IPTG)诱导后,通过SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western blot检测表达蛋白与特异性血清之间的反应性。制备表达蛋白的抗血清,以该抗血清与REV感染的鸡胚成纤维细胞( CEF)进行间接免疫荧光实验(IFA),验证表达蛋白的免疫原性。【结果】经SDS-PAGE电泳后能观察到预期大小的表达条带,Western blot结果显示,重组蛋白能与REV抗血清反应。将表达产物纯化后免疫Balb/c小鼠,制备p30-gp90抗血清,该抗血清与REV感染CEF在IFA中呈现特异性荧光反应。【结论】体外串联表达REV p30-gp90蛋白,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

网状内皮增生病病毒感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

我国鸡群中网状内皮增生病病毒(REV)感染已相当普遍,但对其造成的实际危害却不太清楚。本研究结果表明,1日龄SPF鸡感染REV会显著抑制对新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗的免疫反应。1周龄用相应灭活疫苗免疫后3周、4周和5周,REV感染组对不同病毒疫苗免疫后的HI效价显著低于对照组。高剂量REV感染组的抑制作用大于低剂量感染组,但统计学差异不显著。REV感染可造成中枢免疫器官萎缩,REV感染组的胸腺、法氏囊与体重比显著低于对照组。本研究证明了,REV早期感染会干扰鸡群对NDV、AIV的免疫效果,特别是会严重干扰对AIV疫苗的免疫效果。     

鸡马立克氏病毒和网状内皮增生病毒感染肉鸡时的相互作用

为了研究鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮增生病病毒(REV)共感染时的相互作用,分别在REV母源抗体阳性(REV-Ab )和阴性(REV-Abˉ)及经MDV疫苗CVI988株免疫和不免疫的商品代肉鸡,比较了二种病毒在病毒血症水平和特异抗体效价上的相互影响。结果表明,在未经CVI988株免疫鸡,REV病毒血症对MDV强毒接种后的病毒血症水平及抗体效价无明显影响,但REV病毒血症显著抑制了CVI988疫苗免疫为鸡提供的抵抗力和抗体效价,因而提高了强毒MDV感染后的病毒血症的程度。另一方面,MDV感染会显著减弱REV-Ab 鸡对REV感染的抵抗力,提高REV-Ab 鸡在感染REV后的病毒血症水平并抑制对它的抗体效价。分析表明,MDV和REV共感染主要通过抑制鸡体的免疫功能来影响另一种病毒的复制及其致病作用。     

网状内皮增生病病毒感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用

我国鸡群中网状内皮增生病病毒(REV)感染已相当普遍,但对其造成的实际危害却不太清楚.本研究结果表明,1日龄SPF鸡感染REV会显著抑制对新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗的免疫反应.1周龄用相应灭活疫苗免疫后3周、4周和5周,REV感染组对不同病毒疫苗免疫后的HI效价显著低于对照组.高剂量REV感染组的抑制作用大于低剂量感染组,但统计学差异不显著.REV感染可造成中枢免疫器官萎缩,REV感染组的胸腺、法氏囊与体重比显著低于对照组.本研究证明了,REV早期感染会干扰鸡群对NDV、AIV的免疫效果,特别是会严重干扰对AIV疫苗的免疫效果.     

鸡马立克氏病毒和网状内皮增生病毒感染肉鸡时的相互作用

为了研究鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮增生病病毒(REV)共感染时的相互作用,分别在REV母源抗体阳性(REV-Ab+)和阴性(REV-Ab-)及经MDV疫苗CVI988株免疫和不免疫的商品代肉鸡,比较了二种病毒在病毒血症水平和特异抗体效价上的相互影响.结果表明,在未经CVI988株免疫鸡,REV病毒血症对MDV强毒接种后的病毒血症水平及抗体效价无明显影响,但REV病毒血症显著抑制了CVI988疫苗免疫为鸡提供的抵抗力和抗体效价,因而提高了强毒MDV感染后的病毒血症的程度.另一方面,MDV感染会显著减弱REV-Ab+鸡对REV感染的抵抗力,提高REV-Ab+鸡在感染REV后的病毒血症水平并抑制对它的抗体效价.分析表明,MDV和REV共感染主要通过抑制鸡体的免疫功能来影响另一种病毒的复制及其致病作用.     

分子克隆化禽网状内皮组织增生症病毒传染性及其前病毒全基因组序列研究

利用脂质体转染技术,将含有SNV株禽网状内皮组织增生症病毒 （REV）前病毒全基因组cDNA克隆质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）.用对REV的单克隆抗体和抗REV env-gp90的鼠血清作间接免疫荧光反应,在原始的转染细胞及随后传代的细胞中均显示病毒特异性抗原.而且,在连续传代细胞中的阳性率明显升高.用REV特异性引物对进一步传代后的细胞基因组作PCR,也检测出REV基因组.这些结果均表明所得到的分子克隆化病毒具有传染性,因而也进一步证明所用的质粒克隆包含有具感染性的全病毒基因组.对该全基因组cDNA克隆进行酶切所获得的数个亚克隆进行测序,并将序列进行拼接,完成了REV全基因组序列.REV的这个传染性克隆将有助于进一步研究REV的分子生物学特性.     

整合REV LTR序列的MDV弱毒株的分离鉴定与生物学特性

【目的】从非免疫健康三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV),命名为MDV GD06株,本工作系统研究了其生物学特性。【方法】PCR扩增GD06株Meq基因及短末端重复区(RS)序列,进行序列分析,并用间接免疫荧光试验进行血清型特异性鉴定;通过接种SPF鸡和鸡胚成纤维细胞(CEF)来判定GD06株体内外的增殖能力;为确定GD06株的致病性,用1日龄SPF鸡进行攻毒试验。【结果】GD06株为MDV血清I型病毒,其基因组中自然整合禽网状内皮增殖症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR),Meq基因富含脯氨酸的结构域比参考强毒株Md5多59个氨基酸,与MD商品化疫苗CVI988/Rispens和814株相符,具有弱毒株的特征。在接种CEF细胞96、120、144、168、192 h,GD06株病毒滴度分别为1.9×105、3.9×105、6.1×105、6.5×105、5.8×105PFU,明显比CVI988/Rispens(病毒滴度分别为1.3×105、3.5×105、5.0×105、5.7×105、4.7×105PFU)高(P0.05);接种SPF鸡21、28天,GD06株在鸡体内的病毒滴度分别为740和350 PFU,明显比CVI988/Rispens株(病毒滴度分别为460、216 PFU)高(P0.05),结果表明,GD06株在CEF细胞和鸡体内具有比CVI988/Rispens更快的增殖能力。人工接种攻毒实验表明,GD06株对SPF鸡没有致病性,不引免疫抑制。【结论】研究结果表明,MDV GD06株为国内首次分离的自然整合有REV LTR序列的重组MDV弱毒株。     

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。     

禽呼肠孤病毒感染对鸡法氏囊及免疫应答的影响

研究LY株禽呼肠孤病毒(ARV)感染1日龄SPF鸡后对法氏囊发育影响,对传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)疫苗免疫诱发的抗体的影响,及对强毒株IBDV致病作用的影响。结果表明,LY株ARV感染1日龄SPF鸡可引起法氏囊萎缩和部分淋巴细胞减少,但对增重及AIV和NDV疫苗免疫后抗体滴度却没有显著影响。ARV感染可降低弱毒IBDV疫苗免疫后的抗体反应,但对随后IBDV强毒株攻毒的抵抗力却与对照鸡无显著差异。经IBDV弱毒疫苗免疫后,再接种强毒株IBDV,不会引起死亡,但却仍能显著抑制对AIV、NDV疫苗免疫后的抗体滴度。然而,对于1~7日龄经ARV感染的鸡,IBDV强毒的这种免疫抑制作用又显著低于未经ARV感染的对照鸡。     

分析细胞代谢确定传染性法氏囊病病毒在鸡胚细胞上的增殖

研究了接种病毒后的鸡胚成纤维细胞(CEF)代谢与传染性法氏囊病病毒(IBDV)增殖的关系,结果表明,感染细胞对未感染细胞葡萄糖消耗的相对增加量α可作为IBDV增殖的参数。Α随感染过程而增加,当α达到最大值不再改变时,IBDV增殖也达最大。此点可作为培养IBDV时的收毒点     

一株具有急性致瘤特性的马立克氏病病毒的分离与鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从免疫过CVI988/Rispens疫苗株患马立克氏病(MD)的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV)(命名为YL040920株)。从该分离株蚀斑克隆获得的9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明它较为单一;应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,发现其序列具有MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对毒株的DEF培养物进行检测,发现有特异性的荧光定位于细胞核内;应用毒株感染霞烟鸡,最早在接种后(PI)21d即可诱发明显的内脏器官,在各器官肿瘤中以心脏、肝脏和皮肤的肿瘤发生率最高;用禽肿瘤病三重PCR鉴别诊断技术对毒株的DEF培养物以及感染鸡的内脏器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带,而网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)的检测则均为阴性。研究的结果表明,分离株YL040920为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及疫苗株CVI988/Rispens的混杂,并具有以心脏、肝脏和皮肤肿瘤为主的急性致瘤特性。     

黄羽肉鸡J亚群白血病病毒的分子生物学特性和致病性

通过接种鸡胚成纤维细胞(CEF)、聚合酶链式反应(PCR)技术及特异性单抗的间接荧光抗体反应(IFA),首次从中国地方品系-黄羽肉鸡中分离到J亚群白血病病毒(ALV-J),并对其gp85基因和3′Ter序列及其致病性作了比较分析。结果显示,GD0510A、GD0510B和GD0512的gp85基因编码的氨基酸序列与国内毒株HN0001同源性最高,分别为94.1%、92.5%和95.8%,GD0510A和GD0512的3′Ter核酸序列与国内毒株同源性比较高。分离到的两株ALV-J(GD0510A和GD0512)感染1日龄肉鸡后出现明显生长抑制(P<0.05),并诱发中枢免疫器官法氏囊和胸腺萎缩。两株病毒单独感染均能降低鸡体对新城疫病毒和禽流感病毒(AIV-H5)疫苗的抗体滴度,GD0512感染鸡后能明显抑制感染鸡对新城疫病毒疫苗的免疫反应(P<0.05),而GD0510A感染鸡后在4w时也能明显抑制感染鸡对禽流感病毒(AIV-H5)疫苗的免疫反应(P<0.05)。研究证实在我国地方品系黄羽肉鸡存在ALV-J的感染,分子生物学特性研究表明该毒株可能是来自白羽肉鸡且能造成感染鸡的免疫抑制。     

齐多夫定和单克隆抗体联合应用去除疫苗毒种中REV的污染

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)在禽弱毒疫苗中的污染被认为是REV感染的途径之一,去除疫苗毒种中REV的污染是生产合格疫苗的前提,此前我们研究证实了某IBDV疫苗毒种存在REV的污染,本研究试图通过核苷类逆转录酶抑制剂类药物齐多夫定(Azidothymidine,AZT)和针对REV的单克隆抗体(McAb)单独或联合应用来去除疫苗毒种中REV的污染。将污染REV的IBDV疫苗毒种接种DF-1细胞后,分别经5μg/mL的AZT,5%的McAb或两者联合应用干预后,毒种中污染的REV复制受到了明显的干扰,特别是经过AZT与McAb联合应用两次干预后,检测REV为完全阴性,毒种经检验合格。本研究通过AZT与McAb联合应用成功净化了IBDV疫苗毒种中REV的污染,为解决类似问题提供了新的思路。     

鸡减蛋综合征病毒DNA的基因文库构建和酶切位点分析

腺病毒载体已经成为基因工程疫苗及癌症、遗传病基因治疗的重要工具。腺病毒可分为哺乳动物腺病毒和禽腺病毒,禽腺病毒包括20多个血清型,分别归属于三个群:Ⅰ群为传统的禽腺病毒(FAV),Ⅱ群包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)等,Ⅲ群禽腺病毒为减蛋综合征病毒(EDSV)。这些病毒广泛地存在于多种禽类的呼吸道、消化道,大多呈显性或不显性感染。以禽类腺病毒为载体表达禽类重要病原的保护性抗原基因,构建多价(联)活载体基因工程疫苗,有其重要特点:腺病毒的某些毒株可以在禽体     

网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析

以网状内皮组织增生症病毒(REV)中国分离株HA9901感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组DNA作为其前病毒基因组模板, 根据已发表序列设计合成6对引物, 经PCR扩增出6段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段, 并分别连入T载体进行克隆、测序. 用DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接, 完成了REV第一个中国分离株HA9901前病毒全基因组核苷酸序列. 在从截然不同的地区、不同年份、不同禽类分离到的毒株中, 将该序列与另两个毒株已完成的全基因组序列的比较表明, REV的整个基因组相对保守, 各毒株间对应基因的同源性都在92%以上. 其中, 从我国鸡体分离到的野毒株HA9901与美国鸡源分离株FA在整个基因组上的同源性均显著高于美国的鸭源SNV株.