敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CVI988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较

【目的】比较敲除meq基因的马立克氏病毒(MDV)与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。【方法】本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组,每组30只,分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1;第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens;第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种后5 d后,第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄,记录死亡情况,对死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间,检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。【结果】SC9-1株免疫对感染MDV GX0101攻击SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用;CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%,肿瘤率为16.7%;未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%,肿瘤率为6.67%;相比,空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示,淋巴细胞和羽毛囊DNA中,SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显著低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示,SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。【结论】SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。     

敲除meq的鸡马立克氏病毒强毒株对超强毒的免疫保护作用

【目的】比较和评价一株敲除了meq基因的马立克氏病毒(MDV)的致病性及其诱发的保护性免疫作用。【方法】将1日龄SPF鸡150只随机分为5组,每组30只,分别饲养于正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,第1和第5组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔接种GX0101Δmeq,第2组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔接种CVI988/Rispens疫苗株,第3和第4组鸡不接种任何病毒作为对照组。免疫接种5d后,第1、2、3组分别以500PFU/只的剂量攻击MDV超强毒株vvrMd5。饲养90d,观察死亡情况,对各组死亡鸡只剖检,并取疑似马立克特有病变脏器做石蜡切片,于攻毒后90d处死全部存活鸡并随机取心脏、肝脏、脾脏做病理切片。【结果】单独接种GX0101Δmeq的第5组没有任何马立克氏病临床症状和特有的组织学病变,接种GX0101Δmeq再感染超强毒株vvrMd5的第1组也没有马立克病特有的组织学病变,但CVI988/Rispens免疫后感染超强毒株vvrMd5的第2组显示马立克病特有病变的病理切片比例为9/42,单独接种超强毒株vvrMd5的第3组死亡率为87%,死亡鸡出现可眼观典型肿瘤率为25%,免疫接种GX0101Δmeq和CVI988/Rispens的第1组和第2组对超强毒株vvrMd5攻击的保护指数分别为100%和89%。【结论】本实验构建的MDVmeq基因缺失株-GX0101Δmeq可在体外稳定复制,不仅对SPF鸡没有致病性和致瘤性,而且能诱导比CVI988/Rispens疫苗株更好的对超强毒MDV的免疫保护效果。     

鸡马立克氏病毒和网状内皮增生病毒感染肉鸡时的相互作用

为了研究鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮增生病病毒(REV)共感染时的相互作用,分别在REV母源抗体阳性(REV-Ab )和阴性(REV-Abˉ)及经MDV疫苗CVI988株免疫和不免疫的商品代肉鸡,比较了二种病毒在病毒血症水平和特异抗体效价上的相互影响。结果表明,在未经CVI988株免疫鸡,REV病毒血症对MDV强毒接种后的病毒血症水平及抗体效价无明显影响,但REV病毒血症显著抑制了CVI988疫苗免疫为鸡提供的抵抗力和抗体效价,因而提高了强毒MDV感染后的病毒血症的程度。另一方面,MDV感染会显著减弱REV-Ab 鸡对REV感染的抵抗力,提高REV-Ab 鸡在感染REV后的病毒血症水平并抑制对它的抗体效价。分析表明,MDV和REV共感染主要通过抑制鸡体的免疫功能来影响另一种病毒的复制及其致病作用。     

鸡马立克氏病毒和网状内皮增生病毒感染肉鸡时的相互作用

为了研究鸡马立克氏病病毒(MDV)和网状内皮增生病病毒(REV)共感染时的相互作用,分别在REV母源抗体阳性(REV-Ab+)和阴性(REV-Ab-)及经MDV疫苗CVI988株免疫和不免疫的商品代肉鸡,比较了二种病毒在病毒血症水平和特异抗体效价上的相互影响.结果表明,在未经CVI988株免疫鸡,REV病毒血症对MDV强毒接种后的病毒血症水平及抗体效价无明显影响,但REV病毒血症显著抑制了CVI988疫苗免疫为鸡提供的抵抗力和抗体效价,因而提高了强毒MDV感染后的病毒血症的程度.另一方面,MDV感染会显著减弱REV-Ab+鸡对REV感染的抵抗力,提高REV-Ab+鸡在感染REV后的病毒血症水平并抑制对它的抗体效价.分析表明,MDV和REV共感染主要通过抑制鸡体的免疫功能来影响另一种病毒的复制及其致病作用.     

表达IBDV VP2融合蛋白的重组MDV的构建及其免疫特性

将增强型绿色荧光蛋白基因(eGFP)与鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2基因融合,插入马立克氏病毒(MDV)CVI988/Rispens的非必需区US10片段中,成功构建表达VP2融合蛋白的MDVCVI988转移载体pUC18-US10-VP2。将转移载体质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),筛选获得表达VP2融合蛋白的重组MDV(rMDV)。聚合酶链式反应(PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)证明,rMDV传至第31代仍能稳定表达VP2融合蛋白。用rMDV免疫SPF鸡,进行IBDV攻毒保护试验,1日龄SPF鸡分别用1000PFU、2000PFU、5000PFU的rMDV进行免疫,33日龄用100LD50的IBDVJS超强毒进行攻毒,鸡的免疫保护率分别为50%、60%、80%。值得注意的是,5000PFU的rMDV一次免疫1日龄SPF鸡,其法氏囊组织病理损伤等级与IBD中等毒力活疫苗常规二次免疫相当(2·0/1·5),其保护效果无显著差异(p>0·05),而与非重组病毒免疫组相比较,保护效果差异显著(P<0·01),这表明构建的表达IBDVVP2融合蛋白的rMDV可以有效地为SPF鸡提供免疫保护作用。     

一株具有急性致瘤特性的马立克氏病病毒的分离与鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从免疫过CVI988/Rispens疫苗株患马立克氏病(MD)的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV)(命名为YL040920株)。从该分离株蚀斑克隆获得的9个克隆在蚀斑形成时间及其形态大小上均无明显差别,表明它较为单一;应用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,发现其序列具有MDV-1强毒株的特征;用基于抗MDV-1 MEQ蛋白的单克隆抗体3G12E6的免疫荧光试验(FA)对毒株的DEF培养物进行检测,发现有特异性的荧光定位于细胞核内;应用毒株感染霞烟鸡,最早在接种后(PI)21d即可诱发明显的内脏器官,在各器官肿瘤中以心脏、肝脏和皮肤的肿瘤发生率最高;用禽肿瘤病三重PCR鉴别诊断技术对毒株的DEF培养物以及感染鸡的内脏器官组织进行检测,均能扩增到MDV-1强毒株的特异性带,而网状内皮增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV)的检测则均为阴性。研究的结果表明,分离株YL040920为单一的MDV-1强毒株,无REV、ALV以及疫苗株CVI988/Rispens的混杂,并具有以心脏、肝脏和皮肤肿瘤为主的急性致瘤特性。     

MDV-1 CVI988/Rispens疫苗毒体外感染期间VP22的表达及细胞间转导作用

利用CVI988 VP22蛋白C端94~243 aa片段作为抗原制备特异性抗体, 并用于检测MDV-1不同毒株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)时, 在不同感染时间内的表达情况. 结果发现, 当感染量PFU=50时, MDV各不同致病力的毒株(GA, RB1B和CVI988株)VP22最早在3 h时开始向病毒感染细胞的邻近细胞核内扩散; 8 h时, VP22几乎扩散到所有细胞的核内. 这说明VP22在感染细胞形成空斑之前就已经开始表达, 并高效转导入其他正常的细胞核内. 实验中发现血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)弱毒株CVI988/Rispens的VP22蛋白缺失²⁰¹TKSERT²⁰⁶. 结果证实这一缺失对VP22蛋白转导功能并没有明显影响, 即CVI988 VP22仍具有高效的细胞内转导作用. 这为深入研究和开发MDV CVI988株的VP22蛋白转导功能奠定了基础.     

马立克氏病病毒meq基因敲除株感染性克隆的免疫效果评价

【目的】比较和评价了敲除meq基因的MDV感染性克隆作为新型DNA疫苗的免疫保护效果。【方法】将1日龄SPF鸡饲养于正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,将SPF鸡以10μg/只的剂量通过大腿肌肉注射的方式接种溶解于PBS缓冲液中的敲除meq基因的MDV感染性克隆GX0101 Δmeq-BAC,分别在免疫后5天或12天以500PFU/只的剂量接种超强毒rMd5。饲养90天,观察死亡情况,对每一只鸡剖检并取心脏与肝脏做石蜡切片,进行病理观察。【结果】免疫5天后攻毒,CVI988/Rispens对超强毒rMd5的保护指数可达到87%,GX0101 Δmeq-BAC对rMd5的保护指数仅达33%;而免疫12天后对rMd5的保护指数为53%。【结论】相对于细胞结合疫苗CVI988/Rispens,DNA疫苗在机体内的病毒拯救是使其获得保护力的前提条件,因此有一定的免疫空当期。以GX0101 Δmeq-BAC作为疫苗免疫不仅能使雏鸡在受到超强毒感染时发病延迟,而且还能提供较好的免疫保护效果。     

整合进禽反转录病毒基因组片段的鸡马立克氏病病毒重组野毒株的发现

用对禽网状内皮组织增生病病毒(REV)的单抗从广东和广西分离到的二株马立克氏病病毒(MDV)野毒株做间接荧光抗体试验, 用MDV感染细胞的基因组DNA做斑点分子杂交及PCR显示, 这二株MDV基因组中已整合进REV的LTR序列. 根据MDV基因组上易插入REV的LTR的高频位点的序列合成7条引物, 根据REV的LTR合成4条引物, 由此交叉组成28对引物, 分别从这二个MDV野毒株扩增和克隆已整合进MDV的REV-LTR序列及其相连的MDV序列. 测序证明, 二株中的REV-LTR插入序列及在MDV基因组中短独特序列(US)上的插入位点完全相同. 表明这二个毒株很可能是一次重组事件在鸡群中形成的流行毒株.     

马立克氏病病毒meg基因敲除株感染性克隆的免疫效果评价

摘要：【目的】比较和评价了敲除meq基因的MDV感染性克隆作为新型DNA疫苗的免疫保护效果。【方法】将1日龄SPF鸡饲养于正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,将SPF鸡以10 μg /只的剂量通过大腿肌肉注射的方式接种溶解于PBS缓冲液中的敲除meq基因的MDV感染性克隆GX0101Δmeq-BAC,分别在免疫后5天或12天以500 PFU/只的剂量接种超强毒rMd5。饲养90天,观察死亡情况,对每一只鸡剖检并取心脏与肝脏做石蜡切片,进行病理观察。【结果】免疫5天后攻毒,CVI988/Risp     

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.     

带有REV-LTR片段的马立克氏病毒重组野毒株与超强毒株致病性和传播性比较

摘要：【目的】GX0101是一株插入了禽网状内皮组织增生症病毒(REV)-LTR片段的马立克氏病毒（MDV）重组野毒株,本文将其致病性、致肿瘤性和横向传播能力与超强毒参考株（vvMd5）进行比较。【方法】利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA进行检测。【结果】在经抗MDV疫苗免疫的SPF鸡攻毒试验中表明,GX0101株的致死率28.6%和致肿瘤率7.1%均低于超强毒参考株Md5的致死率63.1%和致肿瘤率19.0%。但是,利用MDV特异性核酸探针对同罩饲养的对照鸡的羽毛囊DNA检测表明,     

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDV CVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒.将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2).用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础.     

马立克氏病病毒38 kd磷蛋白H19-和T65-抗原表位分析及鸡对该抗原表位点突变病毒的免疫反应

对马立克氏病病毒(MDV)38 kd 磷蛋白(pp38)基因的编码序列的测定表明, 所有在间接荧光抗体试验(IFA)中与单抗H19反应的10个不同致病型MDV毒株, 在第320位碱基为“A”, 相应第107位氨基酸是谷氨酰胺, 而在IFA中不与单抗H19反应的疫苗株CVI988相应位点分别是“G”和精氨酸. 另一方面, 在IFA中能与另一个单抗T65反应的毒株, 在第326位碱基是“G”, 第109位氨基酸是甘氨酸, 而其他不与单抗T65反应的毒株, 相应位点碱基和氨基酸分别是“A”和谷氨酸. 通过比较CVI988及其在pp38基因的第320和326位的单一或双碱基点突变病毒CVI988/rpp38(AG)和CVI/rpp38(AA)对H19和T65的反应性, 证明了在第107和109位的谷氨酰胺和甘氨酸分别对pp38上的H19和T65两个抗原表位起关键作用. 比较CVI988及其点突变株CVI/rpp38(AG)在SPF鸡诱发的抗体反应表明, 接种了点突变株CVI/rpp38(AG)鸡的抗体反应出现得比天然株抗体反应明显延缓且显著降低. 进一步对MDV不同抗原成分的相应抗体水平比较表明, 该功能区内可能存在着第3个特异性抗原表位, 它决定于CVI988株pp38第107位的精氨酸, 而且天然CVI988株及其点突变株诱发的抗MDV抗体水平间的显著差异可能正与这个抗原表位相关.     

网状内皮组织增生症病毒中国分离株HA9901全基因组核苷酸序列的测定与分析

以网状内皮组织增生症病毒(REV)中国分离株HA9901感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)基因组DNA作为其前病毒基因组模板, 根据已发表序列设计合成6对引物, 经PCR扩增出6段连续的、相互部分重叠的DNA片段和闭合环形前病毒两末端LTR的连接区段, 并分别连入T载体进行克隆、测序. 用DNAstar软件对测序结果进行剪辑和拼接, 完成了REV第一个中国分离株HA9901前病毒全基因组核苷酸序列. 在从截然不同的地区、不同年份、不同禽类分离到的毒株中, 将该序列与另两个毒株已完成的全基因组序列的比较表明, REV的整个基因组相对保守, 各毒株间对应基因的同源性都在92%以上. 其中, 从我国鸡体分离到的野毒株HA9901与美国鸡源分离株FA在整个基因组上的同源性均显著高于美国的鸭源SNV株.     

表达禽流感病毒M2基因的重组马立克氏病病毒的构建

将禽流感病毒M2基因克隆于真核表达质粒pIRES-EGFP中,使其位于pCMV启动子的调控下,并与绿色荧光蛋白基因（EGFP）串联后,将上述串联基因插入到含MDV CVI988的非必需区US基因的重组质粒pUS2中,构建带标记的重组质粒,然后将此重组质粒转染感染了MDV CVI988的鸡胚成纤维细胞,利用同源重组的方法,筛选了表达禽流感病毒M2基因的重组病毒MDV1。经PCR、Dot-blotting,Western-blotting等实验的结果表明,禽流感病毒M2基因的确插入到MDV1（CVI988）基因组中并获得表达。重组MDV1免疫1日龄SPF鸡21天后,用ELISA可检测到M2蛋白的特异性抗体。接种了重组病毒rMDV的鸡体内针对H9N2疫苗血凝素的抗体滴度(p<0.05)明显提高,以禽流感病毒AIV A/Chicken/Guangdong/00（H9N2）攻毒后进行病毒重分离试验的结果发现,重组病毒能有效地降低病毒的排出量(p<0.01),说明该重组病毒可以用于防制禽流感的免疫。     

表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组马立克氏病毒的构建

用聚合酶链式反应(PCR)方法从真核表达载体pcDNA3.1-VP2中扩增出包含CMV和polyA的VP2表达盒基因片段,经琼脂糖凝胶电泳大小为2.4kb;将该基因片段插入马立克氏病病毒(MDV)CVI988//Rispens的非必需区US10片段中,经SphI酶切分析获得大小为6.0和2.4kb两个片段,表明成功构建出表达VP2基因的MDVCVI988转移载体pUC18-US10-VP2质粒。将质粒与CVI988/Rispens疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过免疫荧光方法筛选,结果获得了表达VP2基因的重组MDV(rMDV-VP2)。用IBDV特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(IFA)证实,rMDV-VP2病毒传至第8代仍能稳定表达VP2蛋白,这为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

含有禽网状内皮组织增生病病毒基因组片段的天然重组禽痘病毒的研究

将国内5个不同生产厂家来源的禽痘弱毒疫苗株和1株禽痘野毒株在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传5代,用禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)特异性的单克隆抗体进行间接免疫荧光试验(Immunonuoreseellee assay,IFA),均检测不到传染性REV。但以6株禽痘病毒(FPV)感染的第2代和第5代细胞基因组提取物为模板,通过PCR均能扩增出REV的长末端重复序列(LTR)和囊膜蛋白(env)基因片段。用特异性核酸探针作分子斑点杂交(Dot blot),结果显示所扩增的PCR条带为特异的REV—LTR和REV—env)基因片段。实验结果表明,国内的一些痘病毒疫苗和野毒株基因组中,已稳定地整合进了REV的基因组成分。     

马立克氏病病毒可感染鸡大脑小胶质细胞并促进其Toll样受体15和1LB基因的转录

体外培养雏鸡大脑神经胶质细胞并纯化得到小胶质细胞。分别用马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)广西超强毒力(vv)株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染小胶质细胞,每日观察病毒感染后的细胞病变效应(CPE);用免疫组织化学法检测病毒感染后小胶质细胞中MDV MEQ蛋白的表达,并用荧光定量PCR(qPCR)以及qRT-PCR法分别检测MDVmeq基因(meq-DNA)的复制以及gB基因mRNA(gB-mRNA)的转录水平。同时用qRT-PCR法检测MDV感染对小胶质细胞Toll样受体家族(TLRs)基因转录的影响。结果发现,YL040920株和CVI988/Rispens株病毒均能感染小胶质细胞,病变细胞呈多灶性脱落并形成空斑,随病变进展迅速增大并融合。可在MDV感染的小胶质细胞核内检测到MEQ蛋白,并在感染细胞中检测到meq-DNA的复制和gB-mRNA的转录。YL040920株感染的小胶质细胞中病毒载量和gB-mRNA的转录水平显著低于以相同病毒量CVI988/Rispens株感染的小胶质细胞中的相应量(P≤0.05/0.001)。MDV感染可上调小胶质细胞TLR15和TLR1LB基因的转录水平。小胶质细胞中TLR15和TLR1LB mRNA的转录水平在YL040920感染1 d后升高,于3 dpi达到最高值,到5 dpi时有所降低。检测到小胶质细胞中TLR1LB mRNA转录水平在CVI988/Rispens感染1 d后升高,到3 dpi时达最高值;而TLR15 mRNA的转录水平在3 dpi后开始升高,二者在5 dpi时均降低。比较YL040920和CVI988/Rispens对TLRs mRNA转录的影响发现vvMDV YL040920感染小胶质细胞后主要促进其TLR15基因的转录(P≤0.01/0.001),而弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染后主要促进TLR1LB基因的转录(P≤0.001)。     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒I型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T-easy载体.将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP.用脂质体将其与CVI988 株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况.表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒.