Smad4基因在人卵巢癌高、低转移细胞系HO-8910和HO-8910PM中的表达及其对肿瘤转移作用的研究

转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）超家族广泛存在于多种生物的各种组织中,参与细胞增殖分化、血管形成、肿瘤发生、细胞外基质形成等多种生物学事件。Smad4是TGF-t3／Smads信号通路中的关键分子,研究表明,Smad4的过表达可以抑制肿瘤细胞的增殖和细胞外基质的合成并诱导凋亡。本实验利用人高低转移性卵巢癌细胞系HO-8910PM和HO-8910细胞系作为对象通过基因转染技术过表达Smad4,     

Smad7对Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用

研究人永生化支气管上皮BEP2D细胞中,作为Smad蛋白家族的抑制分子,Smad7对TGF-β信号通路中Smad2、Smad3、Smad4核转位的抑制作用.培养BEP2D细胞,瞬时转染Smad7真核表达载体pCISmad7.neo,TGF-β刺激,提取细胞核蛋白及总蛋白,用Western blot方法比较瞬时转染Smad7基因前后细胞核中Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达的差异.结果,Smad3在TGF-b作用下有明显的核转位;转染Smad7后Smad3、Smad4的核转位显受到抑制.表明在BEP2D细胞中,Smad7对TGF-β/Smads信号通路的拮抗作用主要通过抑制Smad3的活化、Smad3/Smad4异源复合物的形成及核转位,从而拮抗TGF-β对细胞的生长抑制效应.     

Notchl信号蛋白在卵巢癌细胞系中的表达

目的：检测卵巢癌细胞系中Notchl信号蛋白的表达,为在卵巢癌细胞中对Notchl进行RNA干涉研究的体外实验筛选靶细胞。方法：采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法及Westernblotting对卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO中Notchl进行检测。结果：Notchl信号蛋白在4种卵巢癌细胞系中均有表达,其在HO-8910-PM中表现为高表达,在SKOV3和3AO中表现为中等表达,在HO-8910中表现为低表达。结论：HO-8910-PM适合作为靶细胞,进行Notchl信号蛋白的RNA干涉研究。     

Notch1信号蛋白在卵巢癌细胞系中的表达

目的:检测卵巢癌细胞系中Notch1信号蛋白的表达,为在卵巢癌细胞中对Notchl进行RNA干涉研究的体外实验筛选靶细胞.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及Western blotting对卵巢癌细胞系SKOV3、HO-8910、HO-8910-PM和3AO中Notch1进行检测.结果:Notch1信号蛋白在4种卵巢癌细胞系中均有表达,其在HO-8910-PM中表现为高表达,在SKOV3和3AO中表现为中等表达,在HO-8910中表现为低表达.结论:HO-8910-PM适合作为靶细胞,进行Notch1信号蛋白的RNA干涉研究.     

TGF-β/Smads通路转导蛋白在心力衰竭发病中的研究进展

转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）作用复杂,广泛参与哺乳动物的各种病理生理过程如影响细胞的增殖分化、参与心力衰竭发展。TGF-β信号通路关键的信号传导分子为胞浆蛋白Smads。TGF-β诱导分化心肌成纤维细胞,刺激胶原蛋白等细胞间质成分的合成,促进细胞间质的沉积和抑制弹性蛋白酶等的分泌,刺激蛋白酶抑制剂的表达,从而抑制Ⅰ型胶原成分的降解,促进心肌纤维化发展,进一步了解TGF-β/Smads通路转导蛋白的作用及机制,通过抑制TGF-β/Smads通路转导蛋白作为治疗新靶点为最终防止心力衰竭提供了新的思路。     

Smad7基因对胞外信号调节激酶磷酸化水平的调控

研究在BEP2D细胞中,作为Smads蛋白家族的抑制分子,Smad7对胞外信号调节的蛋白激酶(ERK1／2或p44／42)磷酸化水平的调控。将Smad7真核表达载体或人工合成的Smad7-siRNA转染BEP2D细胞,TGF—β刺激,通过Western印迹检测Smad7对p44／42蛋白磷酸化的影响。结果在永生化BEP2D细胞中,TGF-β1刺激后5min开始,可以检测到磷酸化的p44／42;到60min达到高峰,之后逐渐降低。细胞转染Smad7,TGF-β作用60rain后,p44／42磷酸化水平明显增高;而转染Smad7-SiRNA,TGF-β作用60min后,p44／42磷酸化水平显降低。p44／42蛋白水平基本上不受TGF—β1刺激及Smad7表达水平的影响。以上结果说明,在BEP2D细胞中,Smad7可参与TGF—β对ERK／MAPK通路的活化作用。     

转化生长因子-β信号传导的Smad通路

转化生长因子-β(TGF-b)的信号传导主要通过激活Smad通路实现, Smads复合物与靶基因启动子结合完成对基因转录的调控作用. 多种转录共激活因子和转录共抑制因子与Smads直接结合, 从而协同参与Smads与基因启动子的结合以及对基因转录的调控. 泛素-蛋白水解酶复合体通路(UPP)对Smads的降解是Smad通路的终止机制. TGF- β也能激活MAPK通路等其他信号通路. Smad通路和其他信号通路之间的对话构成了TGF-β信号传导的复杂调节网络.     

TGF-β/Smad信号通路在肾小球硬化模型中表达的意义

目的:通过观察在肾小球硬化动物模型中TGF-β、Smad2和Smad7蛋白和mRNA表达的意义,了解TGF-β/Smads信号通路在肾小球硬化中的作用.方法:制备肾小球硬化动物模型,检测24小时尿蛋白定量、血浆白蛋白及血尿素氮水平,观察肾组织形态学改变;免疫组织化学检测TGF-β1、Smad2和Smad7蛋白水平;荧光定量PCR检测TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的水平结果:TGFβ1、Smad2和Smad7正常情况下普遍在肾小球系膜细胞、肾小管上皮及间质细胞中有少量表达;模型组4周时TGFβ1和Smad2蛋白表达增加,Smad7蛋白表达下降;6～8周时TGF-β1和Smad2蛋白表达明显增加,Smad7蛋白表达明显下降.模型组4周时TGF-β1和Smad2 mRNA出现表达上调,6～8周TGF-β1和Smad2 mRNA表达明显增加.4周时Smad7 mRNA表达下调,6～8周Smad7 mRNA表达明显下降.模型组与对照组比较有显著性差异(p＜0.01).结论:TGF-β/Smad信号通路参与了肾小球硬化的纤维化进程,Smad7是TGF-β/Smad信号通路抑制性调控因子,可能为治疗肾小球硬化提供治疗手段.     

血管平滑肌细胞中ERK通路与TGF-β_1/Smad通路的相互作用

目的:探讨血管平滑肌细胞(VSMC)中TGF-β/Smad与ERK信号转导通路是否存在相互调节关系。方法:原代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞,分四组:①对照组,②TGF-β1组,③ERK阻断剂(PD98059)组和④TGF-β1+ERK阻断剂(PD98059)组。分别用Western blot法检测VSMC内Smad2/3、ERK1/2蛋白表达及磷酸化Smad2/3、磷酸化ERK1/2蛋白含量,RT-PCR方法测VSMC中Smad2、Smad3mRNA的表达。结果:①与对照组相比,TGF-β1组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量增多(P0.05),ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P0.05),TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量无差异;与TGF-β1组相比,TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无差异。②各组的Smad2、Smad3mRNA表达无差异。结论:TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA表达水平无影响。     

中药基于TGF-β/Smad信号转导通路调控肿瘤细胞

转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)是一类具有多种生物学功能的多肽类细胞因子,对细胞生长、分化发挥重要作用,与肿瘤的发生、发展具有十分密切的关系。Smads蛋白作为TGF-β信号转导通路下游重要的信号分子,可直接或与其他通路协同将TGF-β通路的信号从细胞外转导到细胞核内,调控TGF-β在细胞水平介导的多种生物学效应。我国抗癌药物研究中的大量资料表明,中药成分可以延缓肿瘤的发生进程,中药或其提取物可通过TGF-β1、Smads或其他效应因子影响TGF-β/Smad通路的信号转导从而调控肿瘤细胞的活动。本文就国内对中药成分基于TGF-β/Smad信号转导通路调控肿瘤细胞生长方面的研究进展予以综述。     

FAP-alpaha在胞外信号传递中与整合素的关系

目的：研究成纤维激活蛋白（Fibroblast Activation Protein,FAP）在促进卵巢癌细胞发生侵袭、迁移、增殖过程中与整合素α3β1、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）的关系。方法：1）．免疫共沉淀共同检测整合素α3β1、uPAR在HO-8910PM上是否为二聚体。2）．transwell侵袭实验、迁移实验检测抑制整合素α3β1、uPAR后,卵巢癌细胞系HO-8910PM的侵袭迁移能力;3）．抑制整合素α3β1、uPAR后,再给予FAPet对HO-8910PM侵袭、迁移和增殖的影响。结果：1）．整合素α3β1、uPAR在HO-8910PM细胞外同一个位置表达;2）．抑制整合素α3β1能够明显抑制HO-8910PM的侵袭、迁移、增殖能力,并且可以抑制FAP对肿瘤的作用。3）．PAI—1抑制uPAR后,HO—8910PM的侵袭、迁移、增殖无明显变化,同时对FAP也无明显作用。结论：整合素α3β1和uPAR在HO-8910PM是一个复合体,FAPα,在细胞外是通过整合素α3β1传递信号进入细胞内而不是通过uPAR,整合素α3β1是通过uPAR与肿瘤细胞相连接。     

利用四环素调控系统研究 CHIP 对TGF-β信号通路的抑制性调节

为了研究伴侣分子相互作用蛋白 CHIP 对 TGF-β信号通路的调控,利用四环素基因表达调控系统,建立四环素调控表达 CHIP 的稳定细胞系 (Mv1Lu-Tet off-CHIP). 利用此细胞模型,发现 CHIP 的过量表达可显著降低细胞内 Smad2/3 蛋白水平;荧光素酶报告分析也表明开启 CHIP 蛋白表达可明显降低 Smads 介导的基因转录活性;进一步的免疫印迹结果显示 CHIP 蛋白可明显下调 TGF-β所诱导的下游基因 JunB 的表达 . 上述结果提示 CHIP 可以作为一种新的蛋白质分子抑制性调节 TGF-β信号通路 .     

藏红花酸对TGF-β1刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响

目的:研究藏红花酸(crocetin)对转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激的人肝星状细胞LX-2信号转导通路的影响。方法:体外培养LX-2细胞,随机设立空白对照组,模型组,藏红花酸低剂量组,藏红花酸中剂量组,藏红花酸高剂量组,用含10%血清的1640培养液培养48 h,MTT法测各组细胞增殖,蛋白免疫印迹测定各组细胞α-SMA蛋白的表达,实时荧光定量PCR法测各组细胞Smad2、Smad3、Smad7mRNA的表达。结果:与对照组比较,TGF-β1刺激后人肝星状细胞LX-2增殖作用明显,且上调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,下调Smad7mRNA表达(P0.01)与模型组比较,藏红花酸组均能抑制LX-2细胞增殖,并呈剂量依赖性,高、中剂量组作用明显,能够明显下调α-SMA蛋白、Smad2mRNA、Smad3mRNA表达,上调Smad7mRNA表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:藏红花酸对TGF-β1刺激的LX-2细胞中Smad7mRNA具有上调作用,对Smad2、Smad3mRNA具有下调作用,其抗肝纤维化作用可能与抑制TGF-β1/Smads信号转导通路有关。     

TGF-β/Smads在肺癌中的表达研究

转化生长因子TGF-β／Smads是细胞增殖的抑制因子。它可以促进细胞外基质的增生和原发性肿瘤的转移。选择20例肺癌组织标本及8种不同转移能力的肺癌细胞系,通过荧光免疫组织化学染色法进行RⅡ和Smsds蛋白定位及表达分析。初步探讨了TGF-β／Smads信号传导通路与肺癌发生和转移的关系。     

FAPα在胞外信号传递中与整合素的关系

目的:研究成纤维激活蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)在促进卵巢癌细胞发生侵袭、迁移、增殖过程中与整合素α3β1、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR)的关系。方法:1).免疫共沉淀共同检测整合素α3β1、uPAR在HO-8910PM上是否为二聚体。2).transwell侵袭实验、迁移实验检测抑制整合素α3β1、uPAR后,卵巢癌细胞系HO-8910PM的侵袭迁移能力;3).抑制整合素α3β1、uPAR后,再给予FAPα对HO-8910PM侵袭、迁移和增殖的影响。结果:1).整合素α3β1、uPAR在HO-8910PM细胞外同一个位置表达;2).抑制整合素α3β1能够明显抑制HO-8910PM的侵袭、迁移、增殖能力,并且可以抑制FAP对肿瘤的作用。3).PAI-1抑制uPAR后,HO-8910PM的侵袭、迁移、增殖无明显变化,同时对FAP也无明显作用。结论:整合素α3β1和uPAR在HO-8910PM是一个复合体,FAPα在细胞外是通过整合素α3β1传递信号进入细胞内而不是通过uPAR,整合素α3β1是通过uPAR与肿瘤细胞相连接。     

Smad7基因的克隆、表达及对c-myc基因的调控

Smad7是TGr-β家族信号转导通路的抑制分子,可反馈调节TGF-β／Smads信号转导通路,从功能推测,Smad7表达紊乱,可影响细胞对TGF-β的应答,从而促进细胞的恶性化进展,为了深入探讨Smad7基因功能,通过设计引物,用Touchdown巢式．PCR法从人胎脑文库中扩增Smad7基因编码区全长,回收产物,克隆并构建真核表达载体,同融合有报告基因的c-myc顺式增强子元件共转染BEP2D细胞,结果表明：TGF—p可抑制c．myc报告基因的活性,Smad7基因可正调控c．myc报告基因的表达,并拮抗TGF．B对该基因的抑制作用．由此得出结论：Smad7基因通过桔抗TGF．B来调控c．myc基因、     

逆转肾小管上皮细胞转分化的Smad信号转导机制

肾小管上皮细胞转分化(tubular epithelial to menchymal transdifferentiation,EMT)是肾小管间质纤维化的重要病理机制之一。致纤维化细胞因子TGF-β通过几种信号转导途径调节EMT,其中TGF-β/Smads信号通路发挥核心作用。目前研究表明,Smad7、HGF、BMP-7等可通过调控Smads信号通路而逆转EMT,这为肾间质纤维化的防治提供了新的思路。该文主要介绍TGF-β/Smads信号通路在EMT发生的作用,以及Smad7、SnoN、HGF、BMP-7等分子是如何通过抑制Smads信号通路而发挥逆转EMT作用的。     

TGF-β/Smads信号通路介导脯氨酸促进浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积

为了进一步验证转化生长因子(TGF-β) /Smads信号通路在脯氨酸(Pro)促进鱼鳔胶原蛋白沉积中的作用, 研究利用TGF-β/Smads通路抑制剂干扰, 分析干扰前后鱼鳔中胶原蛋白含量及相关基因转录水平的变化。根据前期实验获得的Pro最佳添加量, 制定饲料配方, 饲喂浅色黄姑鱼1月后, 通过腹腔注射氧化苦参碱(Oxymatrine)为期1个月。在实验结束后, 测量各项指标, 评估干扰前后, Pro促进鱼鳔胶原蛋白沉积的效果及变化。实验结果表明: Pro能显著上调TGF-β/Smads通路中相关基因的表达, 并促进鱼鳔胶原蛋白沉积, Oxymatrine干扰显著下调了TGF-β/Smads通路中相关基因(Col1α1、Col1α2、TGF-β和Smad2)表达, 同时导致鱼鳔中胶原蛋白沉积下降。由此推断Pro通过激活TGF-β/Smads通路促进鱼鳔中胶原蛋白沉积, 而Oxymatrine干扰抑制了TGF-β/Smads通路, 导致Smad2与Col1α2启动子结合受阻, 进而下调了Col1α2基因的转录, 从而降低鱼鳔中胶原蛋白的沉积。综上表明, TGF-β/Smads信号通路在Pro促进浅色黄姑鱼鱼鳔胶原蛋白沉积过程中起着重要调控作用, 其中Col1α1、Col1α2、TGF-β和Smad2扮演着重要角色, 研究结果可为鱼类胶原蛋白代谢的营养调控提供新思路和新方法。     

转化生长因子β通过Smad4非依赖的方式促进赖氨酰氧化酶的表达

目的:研究血管平滑肌细胞内转化生长因子β(TGF-β)信号怎样调节赖氨酰氧化酶(LOX)的表达。方法:分离小鼠原代血管平滑肌细胞,用携带不同Smad4干扰序列的慢病毒感染原代细胞,建立Smad4敲低稳定细胞系;分别用TGF-β刺激原代细胞或对照和Smad4敲低细胞,利用免疫印迹及Real-time PCR技术检测Smad4敲低后LOX的表达改变。结果:获得了Smad4敲低的细胞;TGF-β能诱导LOX表达,且在Smad4敲低的细胞内,LOX升高更明显。结论:TGF-β通过Smad4非依赖的方式促进LOX的表达。     

赶黄草总黄酮对活化的肝星状细胞 TGF-β1/Smads信号通路的影响

为研究赶黄草总黄酮对TGF-β1(transforming growth factor beta 1)活化的肝星状细胞的作用及可能的机理,采用TGF-β1诱导人肝星状细胞(hepatic stellate cell LX-2,HSC-LX-2)活化,给予不同浓度赶黄草总黄酮后,MTT法检测赶黄草总黄酮对活化后的LX-2增殖的影响,划痕实验检测细胞迁移率,胶原收缩实验检测胶原收缩情况,酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞培养液中一型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)及纤连蛋白(fibronectin,FN)等细胞外基质的沉积,进一步采用Western blot法检测TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、Smad7的表达。结果显示,赶黄草浓度在为5、9、13 mg/L均可抑制TGF-β1活化后的LX-2的增殖和迁移,且13 mg/L时效果最显著(P0.01);另外,赶黄草总黄酮可减少ColⅠ及FN等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积(P0.01),并抑制胶原收缩;Western blot结果显示,赶黄草总黄酮作用后Smad3、p-Smad2和p-Smad3的表达均显著减少(P0.05),Smad7的表达明显增加。赶黄草总黄酮能明显抑制LX-2的增殖,减少ECM的分泌,其作用机制可能与与其抑制TGF-β1/Smads信号通路传导有关。