人IL17-RD胞外区真核表达及其单克隆抗体的制备

为了进一步研究白介素17受体D (IL-17RD) 在IL-17信号的调节作用,探索是否可以通过单克隆抗体阻断IL-17RD介导的IL-17信号通路而缓解自身免疫疾病,利用昆虫表达载体从Sf9细胞中表达纯化人IL-17RD-ECD蛋白,免疫Balb/C小鼠30 d,取小鼠脾脏细胞并与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,应用有限稀释法进行筛选,经过克隆化后筛选到一株能稳定分泌抗IL-17RD-ECD的杂交瘤细胞株1F8。经过初步鉴定,该细胞株分泌的抗体类型为IgG1+kappa类,经过Western blot     

高原鼠兔低氧诱导因子-1α蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

高原鼠兔生活在青藏高原海拔3 000～5 000 m的区域,具有极强的低温、低氧耐受能力.低氧诱导因子-1(HIF-1)是一种由HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体转录因子,在生物体的低氧适应性调节中起着关键作用.低氧主要通过调节HIF-1α蛋白水平来影响HIF-1α的转录活性.本研究用DNA重组技术将高原鼠兔HIF-1α(pHIF-1α)(538/822)编码基因序列亚克隆至原核表达载体PGEX- 4T-1中,并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,获得可溶性表达产物.将纯化后的GST-pHIF-1α(538/822)融合蛋白作为免疫原免疫家兔制备多克隆抗体.免疫印迹结果表明,制备的抗体能够识别高原鼠兔HIF-1α蛋白.进一步利用亲和纯化的方法对此多克隆抗体进行了纯化.免疫印迹和免疫染色的结果表明,纯化的抗体可以用于检测外源以及内源的高原鼠兔HIF-1α蛋白的表达和定位,为后续的研究提供了重要的实验材料.     

SIPAR和STAT3相互作用并对其信号通路进行负调控

STAT3 对细胞的生长、存活、增殖以及机体的发育都具有重要的作用 . STAT3 基因的失活可以引起多种疾病,而 STAT3 基因的过度激活又可以引发很多癌症 . 为了对 STAT3 信号通路的调控做进一步的研究,采用酵母双杂交的方法,以 STAT3 蛋白全长作为诱饵蛋白,筛选了小鼠 7 天的胚胎文库 . 得到了与 STAT3 相互作用的一个功能未知的蛋白质,将其命名为 SIPAR (Stat3 interacting protein as a repressor). 免疫染色的实验结果表明, SIPAR 是一种在核内分布为主,细胞质中也有少许分布的蛋白质 . 荧光酶活性测定结果表明 SIPAR 对 STAT3 的转录活性具有抑制作用 . 斑马鱼注射实验说明 SIPAR 基因表达严重影响了斑马鱼的正常发育 .     

hNOK抗体的制备及肺癌组织中NOK的表达检测

Novel Oncogene with Kinase-domain (NOK)是一个新的肿瘤相关基因, 其结构上?与受体蛋白相似, 具有一个蛋白激酶结构域。过量表达NOK会导致肿瘤的产生与转移。为了更进一步研究生理状态下NOK的功能, 需要制备NOK特异性的抗体。利用GST融合蛋白制备了人源NOK的多克隆抗体, 并进行了纯化。检测表明所得的抗体具有很高的滴度, 能够特异性检测NOK蛋白的表达。使用该抗体进行了人肺癌组织的免疫组化检测, 发现该抗体能够高效识别组织内源性表达的NOK蛋白, 可为肺癌的诊断提供依据。     

利用四环素调控系统研究 CHIP 对TGF-β信号通路的抑制性调节

为了研究伴侣分子相互作用蛋白 CHIP 对 TGF-β信号通路的调控,利用四环素基因表达调控系统,建立四环素调控表达 CHIP 的稳定细胞系 (Mv1Lu-Tet off-CHIP). 利用此细胞模型,发现 CHIP 的过量表达可显著降低细胞内 Smad2/3 蛋白水平;荧光素酶报告分析也表明开启 CHIP 蛋白表达可明显降低 Smads 介导的基因转录活性;进一步的免疫印迹结果显示 CHIP 蛋白可明显下调 TGF-β所诱导的下游基因 JunB 的表达 . 上述结果提示 CHIP 可以作为一种新的蛋白质分子抑制性调节 TGF-β信号通路 .     

c-Cbl介导了hSef的泛素化和降解

Sef(similar expression to fgf genes)作为FGF信号通路中可诱导的拮抗分子相继在斑马鱼,小鼠,和人类中被鉴定出来,并进行了相应的功能研究.目前对于Sef蛋白本身稳定性的研究还未见报道.对c-Cbl对Sef稳定性的影响进行了研究.免疫荧光实验表明Sef能够和c-Cbl蛋白在细胞中发生共定位,随后的免疫共沉淀实验证明Sef能够和c-Cbl发生相互作用.体内泛素化实验表明c-Cbl能够使Sef发生明显的泛素化作用.这种泛素化最终导致了Sef本身的剂量依赖性的降解.针对c-Cbl的siRNA表达也使Sef稳定细胞系的表达水平得到恢复.结果表明,c-Cbl对Sef的泛素化及降解可能作为一种调控拮抗因子的蛋白质水平从而最终调节信号通路的一种机制.     

hNOK抗体的制备及肺癌组织中NOK的表达检测

Novel Oncogene with Kinase-domain (NOK)是一个新的肿瘤相关基因, 其结构上?与受体蛋白相似, 具有一个蛋白激酶结构域。过量表达NOK会导致肿瘤的产生与转移。为了更进一步研究生理状态下NOK的功能, 需要制备NOK特异性的抗体。利用GST融合蛋白制备了人源NOK的多克隆抗体, 并进行了纯化。检测表明所得的抗体具有很高的滴度, 能够特异性检测NOK蛋白的表达。使用该抗体进行了人肺癌组织的免疫组化检测, 发现该抗体能够高效识别组织内源性表达的NOK蛋白, 可为肺癌的诊断提供依据。     

hSef基因在不同人组织和细胞系的表达分布

将人源Sef蛋白胞内区编码序列与GST融合构建原核表达质粒进行重组蛋白的表达与纯化并制备多抗 .在COS 7细胞中转染表达hSef显示 ,其分子量分别为 80kD ,10 0kD ,比体外翻译的分子量偏大 ,提示可能有糖基化存在 .Northern印迹的结果表明 ,hSefmRNA主要分布在人肾和睾丸组织 .RT PCR检测到hSefmRNA在众多细胞系有广泛存在 .免疫组化的结果显示 ,hSef蛋白在人肾和睾丸及相应癌组织表达水平较高 .