来源于线虫Caenorhabditis briggssae 的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

重组腺病毒介导的人尿激酶原突变体在山羊乳汁中的表达

构建携带人尿激酶原突变体cDNA的重组腺病毒,通过该腺病毒介导实现外源基因在山羊乳腺中表达。通过大肠杆菌内同源重组将人尿激酶原突变体cDNA插入到腺病毒载体中,经过293细胞包装获得重组腺病毒,直接注射到泌乳山羊乳腺,收集感染后1~4天的乳汁,利用纤维蛋白溶圈试验、Western blot、ELISA检测乳清中尿激酶原突变体的表达。结果显示病毒注射后1~4天乳清中均可检测到尿激酶原的表达,其表达量可达0.41mg/ml。该方法可以实现重组蛋白在山羊乳腺的短期表达,可能是大规模生产临床医疗蛋白的一条经济有效的途径。     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

温度对海洋底栖端足类日本大螯蜚(Grandi-dierella japonica)存活、生长和发育的影响

日本大螯蜚（ Ｇｒａｎｄｉｄｉｅｒｅｌｌａ ｊａｐ ｏｎｉｃａ）生长发育的适温范围为 ２０～２６℃。不同发育期耐受温度范围不同,刚孵化幼体温度下限为１１℃,上限为３２℃,以后随着幼体发育,其对低温的适应力逐渐增强。雄性个体对极限温度的忍耐力低于雌性。在耐受温度范围内,幼体的生长发育随着温度的提高而加快。研究结果表明,日本大螯蜚实验室培养温度宜选择在２０～２６℃,用其进行的沉积物急性和慢性毒性生物检验的实验温度均宜选择在 ２０℃。     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及部分序列测定

为了制备乳腺生物反应器所需要的乳腺特异性表达的调控序列,用ＰＣＲ法从奶牛染色体上分５段扩增出了全长的牛 ＢＬＧ基因约 ８ ｋｂ,包括 １．８ ｋｂ的 ５’侧翼区、１．７ ｋｂ的 ３’侧翼区及 ４．７ ｋｂ的ｇＤＮＡ区。扩增出的各片段克隆到Ｔ－Ｖｅｃｔｏｒ上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性。     

CMG2-Fc 融合蛋白突变体筛选及中和炭疽毒素活性分析

目的:筛选能有效中和炭疽毒素和抵抗炭疽毒素损伤细胞的CMG2-Fc(炭疽毒素受体II-人免疫球蛋白Fc段融合蛋白)突变体。方法:运用FoldX等计算软件分析CMG2与PA晶体学结构,设计能提高CMG2-PA亲和力的突变体分子,并与人IgG1Fc片段构成融合基因,转染CHO-S细胞并通过亲和层析获得CMG2-Fc突变体蛋白,通过亲和力检测和细胞保护实验分析各突变体中和炭疽毒素能力。结果:筛选并表达了8个CMG2-Fc突变体分子,亲和力实验显示其中E117Q突变可明显提高CMG2-Fc与PA的亲和力(KD=1.35×10-11 mol/L),细胞保护实验提示E117Q突变能有效提高CMG2-Fc中和炭疽毒素能力(CMG2-Fc(E117Q)的IC50为15 ng/μL,而wt CMG2-Fc的IC50为50ng/μL)。结论:CMG2-Fc(E117Q)突变体分子可作为拮抗炭疽毒素损伤的炭疽治疗药物分子,进行进一步研究。     

基于人免疫缺陷病毒-1的慢病毒载体系统研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体。慢病毒载体已经发展到了第三代,其安全性已经大为提高。经过结构优化的慢病毒载体已经用于转基因动物生产和基因治疗研究,而稳定包装细胞系的建立使得慢病毒的生产更为简便。     

水环境中Cr(Ⅵ)对鱼类毒性机理研究进展

随着工业,特别是不锈钢产业的迅速发展,环境中的铬污染问题日益严重,Cr(Ⅵ)能够很容易地透过细胞膜进入细胞和生物体内,其毒性远高于Cr(Ⅲ).铬作为变价金属,其在鱼类体内能够产生活性氧自由基(ROS),对机体产生氧化胁迫效应;此外,Cr(Ⅵ)在细胞还原作用下生成的中间产物\[Cr(Ⅴ)、Cr(Ⅳ)等\]会进一步和DNA结合,导致基因的损伤和突变,从而危害鱼类的生长发育和种群结构.本文在不同水平上,系统总结了Cr(Ⅵ)对鱼类的毒性效应,从多个层次(分子、细胞、组织、器官、个体）阐述了Cr(Ⅵ)的毒性作用机制和鱼类相应的毒性解毒机制,并对于Cr(Ⅵ)的毒性研究中尚不完全清楚、需要深入考察的方面进行了探讨.     

染色质免疫沉淀法筛选转录因子Nanog调控的目的基因

目的：利用染色质免疫沉淀法筛选转录因子Nanog调控的目的基因。方法：用甲醛固定胚胎干细胞,利用超声将其染色质随机断裂成0.5～1.0kb的染色质片段,通过免疫沉淀富集与Nanog结合的DNA片段,回复交联后分离纯化DNA片段,最终用凝胶迁移阻滞实验验证Nanog与DNA片段的结合。结果：我们发现fzr为Nanog调控的目的基因,并通过电泳迁移率变动分析证明了二者的结合。结论：Fzr在细胞周期调控中发挥重要作用,这为阐明Nanog的作用机理奠定基础。     

小鼠睾丸支持细胞的生物学特性研究

目的:获得高纯度的小鼠支持细胞,用以研究睾丸支持细胞在诱导胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中的作用,同时借助睾丸支持细胞减少进行体内诱导试验时可能产生的免疫排斥反应。方法:用胶原酶和胰蛋白酶组合消化结合选择性贴壁法从1周龄昆明白小鼠睾丸分离获得睾丸支持细胞,纯化后进行体外培养,观察其体外培养的生物学特性。结果:睾丸支持细胞体外培养3～4h即贴壁,贴壁后伸出3～4个突起,为成纤维型细胞,在体外培养2～3d即长满全瓶。油红Ο染色显示,其胞质含有大量脂滴。透射电镜观察结果表明,支持细胞核仁周围有卫星核小体。RT-PCR结果显示获得的细胞表达缪勒管抑制物,不表达促黄体素受体和小鼠VASA同源物。结论:获得了较高纯度的小鼠睾丸支持细胞,可以用于诱导小鼠胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的体内和体外试验。