染色质免疫沉淀技术——一种研究基因表达调控的工具

染色质结构在基因表达调节中起着重要的调节作用。利用甲醛固定活细胞中的DNA与蛋白质,通过免疫沉淀分离复合物的染色质免疫沉淀法是研究体内DNA和蛋白质相互作用的一种新方法,它不仅可用来研究体内反式因子与DNA的相互作用,也可以用来研究组蛋白修饰与基因表达的关系,从而分析蛋白质及其体内的DNA结合序列。目前,该方法在染色质结构研究中获得了广泛的应用。     

一种简便的染色质免疫沉淀法的建立

染色质结构和基因表达调节是当前国际前沿研究的热点.染色质免疫沉淀法是研究染色质结构的首选方法,它不仅可用来研究体内反式因子与DNA的相互作用,也可以用来研究组蛋白修饰与基因表达的关系.综合国外相关文献,建立了一种简便的染色质免疫沉淀法,并通过对诱导前后的MEL细胞中β-珠蛋白基因簇组蛋白H3乙酰化的研究,证实了其可操作性.结果表明：高敏位点HS2和活跃基因βmaj的启动子区域存在较高的组蛋白乙酰化水平,且诱导前后变化显著,而不活跃基因Ey的启动子区域则几乎检测不到组蛋白的乙酰化,且诱导前后无明显变化.这一结果与以前的报道相吻合.     

染色质免疫沉淀技术分析HePG2细胞TCF7L2蛋白与IDE基因转录启动子的结合

TCF7L2是一种重要的转录因子,通过Wnt信号途径,调节葡萄糖代谢.胰岛素降解酶(IDE)是细胞水平催化胰岛素降解的最关键的酶,与2型糖尿病(T2DM)高血糖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症密切相关.为了检测HePG2细胞内转录因子TCF7L2与IDE基因启动子区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术结合PCR技术检测IDE基因启动子序列.结果表明,在特异性TCF7L2抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出IDE基因启动子序列,因此证实在HePG2细胞内,TCF7L2蛋白可与IDE基因转录启动子的特异区域结合,进而可能参与IDE基因的表达调控.     

运用染色质免疫沉淀技术筛选出AP-2α的靶基因GALK1

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域.与其他方法相比,染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay, ChIP ) 是一种近来研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的最好方法之一.本研究利用 ChIP 克隆方法, 找出了 AP-2α所调控的新的下游靶基因 GALK1,并应用 Luciferase assay和 RT-PCR 实验进行了初步的验证.这一新发现,有利于我们进一步研究转录因子AP-2α的功能.     

运用染色质免疫沉淀技术筛选AP-2α的靶基因

在后基因组时代,DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的一个重要领域.染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,简称CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法.对与ChIP有关的实验条件进行了优化,获得了较优的实验条件,并运用ChIP实验筛选出了转录因子activator protein-2 alpha (AP-2a)的未知靶基因,对于进一步研究AP-2a的功能和调控网络打下了基础.     

染色质免疫沉淀技术分析肺腺癌A549细胞中p53蛋白与p21^CIPI和Bim基因转录启动子的结合

为了检测肺腺癌A549细胞内抑癌蛋白p53与CDK抑制蛋白p21^CIPI和Bim基因转录调控区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术,用p53特异性抗体沉淀DNA,PCR检测p21^CIPI和Bim基因5’端特异性序列。结果表明,在抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p21^CIPI和Bim基因5’端的特异性序列。因此证实在A549细胞内,p53蛋白可与p21^CIPI和Bim基因转录启动子的特异区域结合,进而参与两基因的表达调控。     

染色质免疫沉淀技术分析肺腺癌A549细胞中p53蛋白与p21CIP1和Bim基因转录启动子的结合

为了检测肺腺癌A549细胞内抑癌蛋白p53与CDK抑制蛋白p21CIP1和Bim基因转录调控区的结合情况,采用染色质免疫沉淀技术,用p53特异性抗体沉淀DNA,PCR检测p21CIP1和Bim基因5′端特异性序列.结果表明,在抗体免疫沉淀的DNA片段中扩增出p21CIP1和Bim基因5′端的特异性序列.因此证实在A549细胞内,p53蛋白可与p21CIP1和Bim基因转录启动子的特异区域结合,进而参与两基因的表达调控.     

体内甲醛交联及染色质免疫沉淀--研究DNA和蛋白质作用的新方法

甲醛交联及染色质免疫沉淀作用研究体内DNA和蛋白质相互作用的一种新方法,在染色质结构研究中获得了广泛的应用。该方法利用甲醛固定活细胞中的DNA与蛋白质,通过免疫沉淀分离复合物,从而分析蛋白质及其体内的DNA结合序列。     

利用染色质免疫共沉淀技术确定转录因子RIN调控的靶基因

以粉红期番茄果实为材料,用含不同浓度甲醛的缓冲液交联DNA和蛋白质,利用超声波将其染色质随机断裂成大小为200-1 000 bp的片段,用RIN蛋白的特异性抗体免疫沉淀与RIN蛋白结合的DNA片段,然后解交联和纯化DNA片段,最终用普通PCR试验和测序验证与转录因子RIN结合的DNA序列.结果表明,适用于番茄果实的最佳ChIP试验条件为:用1％甲醛溶液交联DNA和蛋白质的复合物;用20％功率,工作6s,间隔10s,脉冲3次超声破碎该复合物,可以得到适当大小的片段,用于后续的试验.普通PCR和测序验证结果证明转录因子RIN与LeACS2和LeACS4启动子区域的CArG box序列结合.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

Nanog基因的功能与调控

胚胎干细胞的无限增殖能力和亚全能性决定了它在再生医学、新药开发及发育生物学基础研究中具有巨大的应用前景。探索维持胚胎干细胞亚全能性的因子及其网络的调控功能成为胚胎干细胞生物学研究的热点。已研究发现多个与维持胚胎干细胞亚全能性相关的基因如Oct4,Nanog,Sox2等,其中Nanog是2003年5月末发现的一个基因,它对维持胚胎干细胞亚全能性起关键性作用,能够独立于LIF／Stat3维持ICM和胚胎干细胞的亚全能性。几年来,Nanog的生物学功能及其与Oct4,Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系已有较为深入的研究,并发现多个调控Nanog表达的转录因子,从而进一步明晰Nanog与已知调控胚胎发育的信号通路之间的关系。在综述Nanog基因的表达特征和功能的基础上、重点探讨Nanog基因表达调控以及Oct4,Sox2等亚全能性维持基因之间的相互作用关系,并对未来的研究趋势予以展望。     

人干细胞转录因子Nanog和BTB/POZ家族蛋白NAC1的相互作用

目的：研究人干细胞转录因子Nanog和BTB/POZ家族蛋白NAC1的相互作用,并初步确定作用区域。方法：应用免疫共沉淀、GSTpull-down实验验证人Nanog与NAC1的相互作用。结果：人Nanog与NAC1能够相互作用,且NAC1的BTB/POZ结构域对于二者相互作用是必需的。结论：人Nanog和NAC1在体内、外均能形成复合物,二者的相互作用对于人胚胎干细胞的自我更新及肿瘤的发生可能具有重要的作用。     

Distinct Cellular Assembly Stoichiometry of Polycomb Complexes on Chromatin Revealed by Single-molecule Chromatin Immunoprecipitation Imaging

Epigenetic complexes play an essential role in regulating chromatin structure, but information about their assembly stoichiometry on chromatin within cells is poorly understood. The cellular assembly stoichiometry is critical for appreciating the initiation, propagation, and maintenance of epigenetic inheritance during normal development and in cancer. By combining genetic engineering, chromatin biochemistry, and single-molecule fluorescence imaging, we developed a novel and sensitive approach termed single-molecule chromatin immunoprecipitation imaging (Sm-ChIPi) to enable investigation of the cellular assembly stoichiometry of epigenetic complexes on chromatin. Sm-ChIPi was validated by using chromatin complexes with known stoichiometry. The stoichiometry of subunits within a polycomb complex and the assembly stoichiometry of polycomb complexes on chromatin have been extensively studied but reached divergent views. Moreover, the cellular assembly stoichiometry of polycomb complexes on chromatin remains unexplored. Using Sm-ChIPi, we demonstrated that within mouse embryonic stem cells, one polycomb repressive complex (PRC) 1 associates with multiple nucleosomes, whereas two PRC2s can bind to a single nucleosome. Furthermore, we obtained direct physical evidence that the nucleoplasmic PRC1 is monomeric, whereas PRC2 can dimerize in the nucleoplasm. We showed that ES cell differentiation induces selective alteration of the assembly stoichiometry of Cbx2 on chromatin but not other PRC1 components. We additionally showed that the PRC2-mediated trimethylation of H3K27 is not required for the assembly stoichiometry of PRC1 on chromatin. Thus, these findings uncover that PRC1 and PRC2 employ distinct mechanisms to assemble on chromatin, and the novel Sm-ChIPi technique could provide single-molecule insight into other epigenetic complexes.