DNA甲基化抑制鼻咽癌细胞系膜联蛋白A1基因表达

为了研究不同分化程度和转移潜能鼻咽癌(NPC)细胞系膜联蛋白A1(ANXA1)mRNA和蛋白质表达情况及其与基因甲基化的关系．培养NPC细胞系CNE1、CNE2、5-8F、6-10B和永生化非癌性人鼻咽黏膜上皮细胞NP69细胞用于实验,用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)方法检测ANXA1基因甲基化状态,同时利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测ANXA1基因的mRNA表达水平．然后用不同浓度的5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-2dC)对NPC细胞进行去甲基化处理,MSP和RT-PCR方法检测处理组和对照组细胞ANXA1基因甲基化状况和mRNA表达水平,并用Western-blotting方法检测ANXA1基因蛋白质表达水平．结果发现,NP69细胞ANXA1基因无甲基化,4株NPC细胞系ANXA1基因都存在不同程度的甲基化,甲基化程度与细胞的分化程度和转移潜能相关．NPC细胞ANXA1基因mRNA表达水平降低,低于NP69细胞,其降低的程度与基因的甲基化程度相关．5-aza-2dC能够剂量依赖性地引起ANXA1基因去甲基化,经去甲基化处理后,NPC细胞系ANXA1基因的mRNA和蛋白质的表达水平相应提高．研究证明,NPC细胞系ANXA1基因的mRNA和蛋白质表达水平出现下调,甲基化是导致表达下调的主要原因,5-aza-2dC去甲基化处理能够恢复ANXA1基因的表达水平．     

表皮生长因子受体调控的人鼻咽癌细胞系CNE2分泌蛋白质的筛选

为筛选表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)调控的鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞的分泌蛋白质,揭示EGFR在NPC发病中的作用机制,采用无血清培养法培养NPC细胞系CNE2,并用转化生长因子(transforminggrowthfactor-α,TGF-α)刺激CNE2细胞24h作为实验组,对照组CNE2细胞不用TGF-α刺激.超滤法脱盐并浓缩两组细胞的培养上清制备分泌蛋白,采用双向凝胶电泳技术(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)分离两组细胞的分泌蛋白,PDquest图像分析软件识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)鉴定差异表达蛋白.建立了实验组和对照组CNE2细胞分泌蛋白的2-DE图谱,图像分析识别了22个差异蛋白质点,质谱鉴定了8个非冗余蛋白质,其功能涉及肿瘤细胞侵袭转移、细胞凋亡和增殖,为进一步揭示EGFR在NPC发病中的作用及其机制奠定了基础.     

应用蛋白质组学和RNAi技术筛选鼻咽癌细胞中p53功能相关蛋白质

为了阐明鼻咽癌中高表达的p53蛋白聚集与失活的机制,高通量地检测与p53功能相关的蛋白质,首先采用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默鼻咽癌细胞系CNE2的p53基因表达,然后用蛋白质组技术研究稳定沉默该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响.通过对稳定干扰p53基因后鼻咽癌细胞系CNE2的蛋白质表达谱改变的研究,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析和电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)验证鉴定了22个差异表达蛋白质.在这些差异表达蛋白质中,有些是已经报道的p53功能相关蛋白质,如热休克蛋白27(HSP27)、异质性胞核核糖核蛋白K(hnRNPK)、14-3-3σ等,其他可能是新的p53功能相关蛋白质,如eIF4B、TPT1、hnRNPH3、SFRS1等.部分差异表达蛋白质如HSP27、14-3-3σ和GRP75经蛋白质印迹分析技术进行了验证,同时pcDNA3.1-FLAG-p53质粒转染CNE2细胞引起了HSP27、14-3-3σ表达下调,GRP75表达上调.在鼻咽癌细胞中鉴定的22个差异表达蛋白质大致可以分为5类,包括信号传导相关蛋白质、分子伴侣、与转录和翻译相关蛋白质、代谢相关蛋白和细胞结构相关蛋白质,涉及到细胞周期的调控、分子基因表达调控、细胞黏附、细胞代谢等众多事件,它们可能作为p53功能相关蛋白质,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索.     

人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学(proteomics)研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(serologicproteomeanalysis ,SERPA)筛选肺癌分子标志物.对10例人肺鳞癌组织,应用双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)技术对同一肺鳞癌组织的细胞总蛋白同时进行电泳后获得3张相同的凝胶,其中一块2 DE凝胶经银染显色作为平行胶,其余两块2 DE凝胶经电转膜将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素(NC)膜上,然后分别与肺癌患者的自身血清以及正常对照血清进行Western印迹分析,获取Western印迹反应图谱.经计算机图像分析识别差异反应的蛋白质,然后与平行胶比较找出相应的差异反应蛋白质点.获得了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常对照血清的Western印迹反应图谱;图像分析共识别36±8个差异反应的蛋白质;在平行胶上找到了匹配的差异反应蛋白质点.对2 0个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出14个与细胞生长增殖、细胞代谢、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关抗原.通过血清蛋白质组技术对肺鳞癌组织进行的研究,建立了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常血清的Western印迹反应图谱,成功鉴定14个肺鳞癌相关抗原,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估     

鼻咽癌细胞中p53相互作用蛋白质的分离和鉴定

鼻咽癌中p53基因突变罕见,但绝大部分鼻咽癌中存在p53蛋白过表达/聚集且功能失活.然而,到目前为止p53蛋白失活的机制仍然不清楚.为揭示鼻咽癌中p53蛋白功能失活的机制,采用免疫共沉淀技术分别富集鼻咽癌细胞系HNE1和HNE2的p53结合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对免疫沉淀复合物进行分离,从胶中切取p53结合蛋白条带,胶内酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析,得到相应的肽序列标签（peptide sequence tags, PST）,通过搜索数据库在鼻咽癌细胞系中鉴定了9个p53结合蛋白.分别是热休克蛋白70（HSP70）家族成员GRP-78和GRP-75、HSP90家族成员GRP-94、核纤层蛋白A/C （Lamin A/C）、α-actinin 4、Ezrin/Cytovillin、DNA复制准许因子/MCM3蛋白(DNA replication licensing factor/minichromosome maintenance 3 protein, MCM3)、CD98/4F2 heavy chain和蛋白激酶C（PKC）.并用免疫共沉淀和蛋白质印迹分析技术对HNE₁细胞蛋白条带3鉴定的p53相互作用蛋白之一HSP78进行了验证.首次在鼻咽癌细胞中鉴定了9个p53结合蛋白,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索.     

表达血管内皮生长因子-siRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建及其应用研究

构建了新型联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK,研究其在人胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达和杀伤作用.构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)的干扰质粒pGenesil-VEGF-siRNA,采用PCR法从中扩增siRNA表达框(含U6启动子),亚克隆至双自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK,构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK;通过酶切、测序等鉴定重组质粒;以磷酸钙纳米颗粒为载体,将干扰质粒、双自杀基因质粒及联合基因质粒转染SGC7901细胞,RT-PCR、Western-blot验证目的基因表达;MTT法检测转染细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性.结果表明:酶切及测序证实联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK构建成功;SGC7901细胞转染联合基因质粒后,RT-PCR、Western-blot证实融合自杀基因表达,而VEGF基因表达下调;在前体药物5-FC作用下,转染联合基因组细胞存活率最低,与其他组比较有统计学差异.成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-si...     

人原发性肺腺癌转移相关分子的定量蛋白质组学研究

癌细胞转移是人原发性肺腺癌(lung adenocarcinoma, AdC)死亡率高和预后差的主要原因．为了筛选潜在的肺腺癌转移相关分子标志物,依据临床诊断选取无转移的肺腺癌组织和有转移的肺腺癌组织作为研究对象,首先采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)对两组肺腺癌组织中的癌细胞进行纯化,再利用荧光差异凝胶电泳技术(two-dimensional differential in-gel electrophoresis, 2D-DIGE)分离无转移肺腺癌组和有转移肺腺癌组的癌细胞总蛋白,通过Decyder软件分析两组差异表达的蛋白质点,质谱(mass spectrometry, MS)对差异表达的蛋白质点进行鉴定,Western blot验证部分差异蛋白annexin A1, annexin A2, annexin A3, B23和 S100A9的表达．建立了LCM 纯化的无转移和有转移的肺腺癌组织癌细胞的2D-DIGE图谱,质谱鉴定了20个非冗余差异蛋白质,其中12个蛋白质在有转移肺腺癌组中较无转移肺腺癌组表达上调,8个蛋白质在有转移肺腺癌组中表达下调．Western blot验证分析显示,差异蛋白annexin A1,annexin A2,annexin A3和 S100A9的表达水平在有转移肺腺癌中较无转移肺腺癌增高,B23的表达水平在有转移肺腺癌中较无转移肺腺癌降低．免疫组化进一步证实S100A9在有转移的肺腺癌中较无转移的肺腺癌中表达上调．首次应用LCM技术联合2D-DIGE及MS技术分析鉴定出肺腺癌转移相关蛋白质,为研究肺腺癌的转移分子机制、筛选预测肺腺癌转移的分子标志物奠定了基础．     

应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关蛋白质

胃癌多药耐药性是临床胃癌化疗失败最主要的原因之一,但其分子机制仍然不太清楚.为了寻找新的胃癌耐药相关的蛋白质,揭示胃癌多药耐药的分子机制,以胃癌细胞SGC7901和长春新碱诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/VCR为研究对象,应用二维凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)技术分离两种细胞的总蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)及电喷雾电离串联质谱(electrosprayionizationtandemmassspectrometry,ESI-Q-TOF)对差异表达的蛋白质点进行鉴定,蛋白质印迹和实时RT-PCR验证部分差异蛋白质在两株细胞中的表达水平,反义核酸转染技术分析HSP27(heatshockprotein27,HSP27)高表达与SGC7901/VCR耐药的相关性.得到了分辨率较高、重复性较好的两株细胞系的二维凝胶电泳图谱,质谱分析共鉴定了24个差异蛋白质点,蛋白质印迹和实时RT-PCR验证了部分差异蛋白的表达水平,反义寡核苷酸抑制HSP27表达能增加SGC7901/VCR对长春新碱的敏感性.研究结果不仅提示这些差异蛋白质如HSP27,Sorcin等可能与胃癌的多药耐药相关,而且为揭示胃癌细胞的多药耐药性产生机制提供了线索.     

采用蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞的甲基化沉默基因

为筛选鼻咽癌的甲基化沉默基因,采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2-dC)处理与未处理鼻咽癌细胞5-8F的蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质.然后采用Western blotting和RT-PCR检测差异蛋白质nm23-H1在药物处理与未处理5.8F细胞中的表达水平,采用甲基化特异性PCR(MS-PCR)检测nm23-H1基因在药物处理与未处理5-8F细胞中的甲基化水平.建立了5-aza-2-dC处理与未处理5.8F细胞蛋白质的2-DE图谱,识别了49个差异表达的蛋白质点,鉴定了33个差异表达的蛋白质,其中包括rim23.H1在内的15个蛋白质在5-aza-2-dC处理后的5-8F细胞中表达上调,而18个蛋白质表达下调.Western blotting和RT-PCR结果显示,nm23-H1在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后表达上调,MS-PCR结果显示,在5-aza-2-dC处理5-8F细胞后nm23-H1基因甲基化水平下降,结果证实,nm23-H1基因是5-8F细胞中的甲基化沉默基因.15个5-aza.2-dC处理后表达上调的基因可能是5-8F细胞中的甲基化沉默基因,为筛选鼻咽癌甲基化失活基因提供了科学依据.     

肺鳞癌患者与健康人血清的差异蛋白质组学研究

为筛选肺鳞癌的血清标志物,采用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离I期肺鳞癌患者和健康人的血清蛋白质,PDquest图像分析软件识别差异蛋白质点,电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)鉴定差异蛋白,然后应用蛋白质印迹和免疫组化方法分别检测差异蛋白——结合珠蛋白-2(haptoglobin-2,HP-2)在肺鳞癌患者血清和健康人血清以及肺鳞癌组织和癌旁正常支气管上皮组织中的表达.建立了肺鳞癌患者和健康人血清的2-DE图谱,图像分析软件识别了1O个差异蛋白质点,质谱鉴定了4种差异蛋白;蛋白质印迹分析显示,HP-2在肺鳞癌血清中的表达水平显著高于健康人(P<0.05),但其表达水平与肺鳞癌的临床分期无明显相关性;免疫组化结果显示,HP-2在肺鳞癌组织中的表达水平高于癌旁正常支气管上皮组织(P<0.05).研究结果提示:HP-2是候选的肺鳞癌血清分子标志物,血清中HP-2水平对肺鳞癌诊断可能具有一定的参考价值;肺鳞癌组织中HP-2表达上调可能是患者血清中HP-2表达升高的原因之一.