应用蛋白质组学和RNAi技术筛选鼻咽癌细胞中p53功能相关蛋白质

为了阐明鼻咽癌中高表达的p53蛋白聚集与失活的机制,高通量地检测与p53功能相关的蛋白质,首先采用RNA干扰(RNAi)技术稳定沉默鼻咽癌细胞系CNE2的p53基因表达,然后用蛋白质组技术研究稳定沉默该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响.通过对稳定干扰p53基因后鼻咽癌细胞系CNE2的蛋白质表达谱改变的研究,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析和电喷雾串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)验证鉴定了22个差异表达蛋白质.在这些差异表达蛋白质中,有些是已经报道的p53功能相关蛋白质,如热休克蛋白27(HSP27)、异质性胞核核糖核蛋白K(hnRNPK)、14-3-3σ等,其他可能是新的p53功能相关蛋白质,如eIF4B、TPT1、hnRNPH3、SFRS1等.部分差异表达蛋白质如HSP27、14-3-3σ和GRP75经蛋白质印迹分析技术进行了验证,同时pcDNA3.1-FLAG-p53质粒转染CNE2细胞引起了HSP27、14-3-3σ表达下调,GRP75表达上调.在鼻咽癌细胞中鉴定的22个差异表达蛋白质大致可以分为5类,包括信号传导相关蛋白质、分子伴侣、与转录和翻译相关蛋白质、代谢相关蛋白和细胞结构相关蛋白质,涉及到细胞周期的调控、分子基因表达调控、细胞黏附、细胞代谢等众多事件,它们可能作为p53功能相关蛋白质,为阐明鼻咽癌中p53蛋白聚集及失活的机制提供了重要依据和线索.     

维持性血液透析患者血清sTWEAK水平与冠状动脉钙化的相关性研究

目的:探讨维持性血液透析患者血清可溶性肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂(s TWEAK)水平与冠状动脉钙化的关系。方法:选择维持性血液透析患者60例和健康对照组30例,采用双抗体夹心酶联免疫吸附技术测定其血清s TWEAK水平,采用多层螺旋CT(MSCT)测定其冠状动脉钙化积分(CACs),比较两组的血清s TWEAK水平、CACs,并分析二者的相关性及血液透析患者冠状动脉钙化的危险因素。结果:血液透析患者血清s TWEAK水平显著低于正常对照组,分别为186.23(148.35,220.74)pg/m L和265.13(210.91,298.22)pg/m L,差异有统计学意义(P<0.01)。CACs>400的血液透析患者血清s TWEAK水平显著高于CACs≤400者,分别为220.73(189.70,251.67)pg/m L和146.07(138.43,180.11)pg/m L,差异有统计学意义(P<0.01)。Spearman等级相关分析显示血液透析患者的血清s TWEAK水平与患者的CACs呈明显正相关(r=0.482,P<0.01)。多因素逐步回归分析显示影响血液透析患者CACs严重程度的因素有血清s TWEAK水平、年龄、透析龄、糖尿病(P<0.05)。结论:维持性血液透析患者血清s TWEAK水平较正常人降低,但在血液透析患者s TWEAK范围内,高水平的血清s TWEAK水平与重度冠状动脉钙化相关;血清s TWEAK可能参与了血液透析患者冠状动脉钙化的发生、发展。     

荧光定量PCR精确检测人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数方法的建立

建立一种精确定量人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数的方法。构建包含线粒体DNANDl和核单拷贝基β-globin基因序列的重组质粒作为标准品;收集无饲养层培养体系下人胚胎干细胞DNA样本,结合2个单独的Taqman探针实时荧光定量PCR对待测样本中线粒体NDl和核β-globin基因分别进行定量,从而对人胚胎干细胞线粒体DNA的含量进行了精确定量。结果提示,人胚胎干细胞线粒体DNA的平均拷贝数／细胞为1321±228。研究表明,该技术可对人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数进行准确的测定,为研究培养条件对人胚胎干细胞线粒体DNA拷贝数的影响及优化体外培养条件奠定了基础。     

利用逆转录病毒载体建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系

目的:建立SMAD2稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法:利用包装细胞获得重组的逆转录病毒,感染人类胚胎干细胞,为干扰组ShSMAD2、载体组VECTOR和野生型组WT;经荧光筛选获得阳性克隆;Realtime-PCR检测SMAD2 mRNA的表达。结果:带GFP荧光标记的SMAD2特异性shRNA逆转录病毒感染人类胚胎干细胞后,获得稳定干扰SMAD2表达的人胚胎干细胞系。经检测shSMAD2组SMAD2 mRNA表达较VECTOR和WT组明显降低,VECTOR和WT组之间无明显差异。结论:通过SMAD2特异性shRNA逆转录病毒载体构建了稳定干扰SMAD2的人类胚胎干细胞。