Ad5-knob蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其活性检测

采用PCR技术, 从AdEasy-1质粒DNA中获得knob全长序列, 克隆入pGEM-T vector中.DNA测序鉴定后, 构建pQE-30/knob重组表达载体, 转化大肠杆菌M15 pREP4),IPTG诱导表达腺病毒5型纤维蛋白的knob功能域(Ad5-knob), SDS-PAGE分析,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中.经Ni2+-NTA亲和层析一步分离纯化后,洗脱产物中Ad5-knob蛋白纯度超过95%.N-端氨基酸测序证实了纯化产物为Ad5-knob蛋白,细胞受体结合实验检测到所得蛋白能够与Hela细胞上的相应受体特异性结合.上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性Ad5-knob蛋白,一步即纯化该蛋白,并具有良好的生物活性,为其下阶段的深入研究提供了重要的实验材料.     

生防菌Ⅲ-61抗真菌活性产物的摇瓶发酵

对生防链霉菌Ⅲ-61产生抗真菌活性物质的摇瓶发酵工艺进行了研究。利用正交试验设计优化了发酵培养基组分,其最适配方为黄豆粉1．5％,蛋白胨0．3％,蔗糖1．0％,淀粉1．3％,磷酸二氢钾0．02％,硫酸镁0．025％,氯化钠0．5％,配咸水溶液,调pH至7～7．4,加碳酸钙1％。通过单因素试验,筛选获得了最优培养条件组合：液体种龄24h,接种量5％～10％,500mL摇瓶培养基装量为80mL,摇床转速240r／min,培养温度31℃,发酵周期96～120h。此优化的发酵培养基与发酵条件的组合昕得菌株Ⅲ-61发酵液对主要靶标黄瓜灰霉病菌的抑菌圈直径达49．5mm,较优化前提高了45．59％。     

贵州百花湖鱼体汞污染现状

以西南汞污染严重的贵州百花湖为对象,选取湖中优势鱼、贝类,通过测定其总汞和甲基汞含量,并结合水体、沉积物汞含量和相关水质参数,探讨了百花湖鱼类汞污染的现状及其影响因素.百花湖鱼体总汞平均含量为28.0ng·g-1,变化范围为4.2～143ng·g-1;甲基汞的平均含量为10.9ng·g-1,变化范围为3.0～39.3ng·g-1.虽然百花湖遭受上游贵州有机化工厂含汞废水的严重污染,但鱼体汞含量并没有超过国家食品卫生标准.其主要原因可能是:百花湖的鱼主要是人工养殖的草食性或杂食性鱼类,鱼龄较小,且其摄取的食物汞含量低、食物链简单,不利于汞的富集;其次,其较快的生长速度对鱼体汞具有生物稀释的作用.     

表达血管内皮生长因子-siRNA及双自杀基因yCDglyTK的联合基因载体构建及其应用研究

构建了新型联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK,研究其在人胃癌细胞系SGC7901细胞中的表达和杀伤作用.构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)的干扰质粒pGenesil-VEGF-siRNA,采用PCR法从中扩增siRNA表达框(含U6启动子),亚克隆至双自杀基因载体pcDNA3.1(-)CV-yCDglyTK,构建联合基因质粒pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK;通过酶切、测序等鉴定重组质粒;以磷酸钙纳米颗粒为载体,将干扰质粒、双自杀基因质粒及联合基因质粒转染SGC7901细胞,RT-PCR、Western-blot验证目的基因表达;MTT法检测转染细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性.结果表明:酶切及测序证实联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-siRNA/yCDglyTK构建成功;SGC7901细胞转染联合基因质粒后,RT-PCR、Western-blot证实融合自杀基因表达,而VEGF基因表达下调;在前体药物5-FC作用下,转染联合基因组细胞存活率最低,与其他组比较有统计学差异.成功构建联合基因载体pcDNA3.1(-)VEGF-si...     

IGFBP3基因启动子高甲基化所致表达下降促进胃癌化疗耐药

目的:研究胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)在胃癌化疗敏感及化疗耐药细胞和组织中的表达情况,初步探讨其在胃癌化疗耐药中的作用及表达异常机制。方法:采用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白质免疫印迹实验(WB)的方法检测IGFBP3在化疗药物敏感的胃癌细胞AZ521、SC-M1,对应顺铂耐药细胞AZ521/cisplatin、SC-M1/cisplatin和胃癌组织中的表达水平;在降低和增加IGFBP3表达量后,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂及流式细胞术(FCM)检测胃癌细胞对化疗药物的敏感性的变化;甲基化特异性PCR(MSP)检测IGFBP3基因启动子区甲基化水平。结果:IGFBP3在化疗耐受的胃癌细胞及组织中表达低于化疗敏感的胃癌细胞及组织(P0.05);在敏感细胞中干扰IGFBP3表达可促进胃癌细胞的耐药性,而在耐药细胞中恢复IGFBP3表达可显著逆转耐药性;MSP结果显示,IGFBP3的表达受DNA甲基化调控,耐药细胞中IGFBP3启动子高甲基化导致其表达下降(P0.05);甲基转移酶抑制剂地西他滨(DAC)处理耐药的胃癌细胞,可恢复IGFBP3表达,并提高其对化疗药物的敏感性(P0.05)。结论:IGFBP3启动子区发生DNA高甲基化导致其表达下降,使得化疗药物诱导胃癌细胞发生凋亡的能力下降,最终导致胃癌细胞的化疗耐药。     

黑曲霉菌剂不同处理对西瓜根际细菌群落及土壤理化性质的影响

【背景】针对我国设施栽培西瓜土传病害发生严重、土壤理化性质劣变等问题,探究微生物菌剂对西瓜根际土壤微生物群落调控及土壤营养改良的作用。【目的】研究黑曲霉菌剂不同处理方式对设施栽培西瓜根际细菌多样性、群落结构及土壤理化性质的影响。【方法】通过高通量测序分析黑曲霉菌剂不同处理对西瓜根际土壤细菌多样性和群落结构的影响;采用分析化学方法测定西瓜根际土壤理化性质并解析驱动西瓜根际细菌群落动态变化的主要理化因素。【结果】黑曲霉菌剂(Y)、氨基寡糖素水剂(A)及黑曲霉菌剂与氨基寡糖素水剂配施(YA)处理,细菌α多样性指数如Chao1、Ace和Shannon等较对照均有所增加;不同处理西瓜根际优势细菌在门水平包括变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteriota)等,其中Proteobacteria相对丰度最高,依次为A (28.26%)>Y (26.74%)>YA (22.61%);黑曲霉菌剂处理西瓜根际土壤芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)和类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)相对丰度较对照明显提高到4.06%和2.43%,氨基寡糖素水剂处理中根际土壤假单胞菌属(Pseudomonas)丰度显著提高(P<0.05),不同处理组微枝形杆菌属(Microvirga)相对丰度较对照均有所提高;黑曲霉菌剂单独或与氨基寡糖素水剂配施处理,西瓜根际土壤全氮、全磷及速效磷含量明显提高;冗余分析(redundancy analysis, RDA)表明,土壤pH、全氮、速效磷、速效钾与西瓜根际细菌群落结构具有显著相关性(P<0.05);Spearman相关性分析表明,根际假单胞菌科相对丰度与土壤全氮、全磷、速效磷、速效钾呈显著或极显著正相关。【结论】黑曲霉菌剂在设施栽培西瓜种植中单独或与氨基寡糖素水剂配施处理,具有提高西瓜根际土壤细菌多样性、增加有益菌群相对丰度、改良土壤理化性质从而提高土壤肥力的作用,该结果为黑曲霉菌剂产品开发及在设施栽培西瓜种植中合理应用提供了科学依据。     

利迪链霉菌A02抗真菌活性产物的分离和结构鉴定

利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物病原真菌高效拮抗菌株。为了明确其抑菌活性的物质基础,利用大孔树脂和硅胶吸附柱层析、HPLC循环制备分离等方法,从菌株A02发酵液中分离获得了纯度达99.845%以上的单一组分活性化合物。经紫外光谱、高分辨质谱、红外光谱和核磁共振谱的测定和解析,确定了该活性化合物的分子量为665,分子式为C33H47NO13,化学结构与四烯大环内酯类抗生素纳他霉素相同。这一结果揭示了利迪链霉菌产生抗真菌天然产物的新功能,并为纳他霉素在植物病害生物防治中的应用开拓了新的途径。     

纳他霉素及其生产菌育种研究进展

纳他霉素是一种高效、广谱、安全的抗真菌天然产物,广泛用做食品防腐添加剂和医用抗菌剂,对植物病原真菌也有强烈抑制作用。由于其主要通过褐黄孢链霉菌等发酵生产,因此高产菌种的选育是纳他霉素研究的热点之一。介绍了纳他霉素的主要理化性质、抑菌特性及其在不同领域的应用,综述了其生产菌育种研究进展,并对不同的育种方法进行了简要的比较分析,探讨了纳他霉素高产菌种选育的发展前景。     

磷酸钙纳米介导自杀基因载体的构建及其应用研究

构建由CEA启动子、CMV增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CVyCDglyTK表达载体和分别由CEA启动子和巨细胞病毒(CMV)增强子驱动的融合自杀基因PCDNA3.1(-)CEAyCDglyTK、PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK表达栽体.以磷酸钙纳米为载体分别转染CEA阳性的人结肠癌细胞株LOVO细胞和CEA阴性的HeLa细胞,Lovo细胞在感染以上3种质粒表达栽体后均有yCDglyTK mRNA表达,且对5-FC的敏感性明显增强:HeLa细胞在纳米PCDNA3.1(-)CMVyCDglyTK复合物感染后有yCDglyTK mRNA表达,对5-FC的敏感性增强,而在另外两种复合物感染后则没有yCDglyTK mRNA表达,5-Fc对其亦无杀伤作用,结果表明靶向性基因治疗栽体能使融合自杀基因在CEA阳性细胞中专一性表达,达到靶向治疗肿瘤的目的.