食管癌细胞NGAL基因－152 ～ －60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) 基因过表达,但过表达机制不明. 最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件. 为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL 5′ 侧翼区－152～+84、－140～+84、－78～+84、－59～+84、－50～+84、－41～+84、－37～+84、－29～+84和－10～+84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体. 将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL －152～+84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位. 结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于－152～－60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强. 生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型. 研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

食管癌细胞NGAL基因-152～-60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)基因过表达,但过表达机制不明.最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件.为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL5′侧翼区-152～ 84、-140～ 84、-78～ 84、-59～ 84、-50～ 84、-41～ 84、-37～ 84、-29～ 84和-10～ 84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体.将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL-152～ 84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位.结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于-152～-60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强.生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型.研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

食管癌细胞NGAL5′侧翼区存在TPA应答元件

在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中,NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin)过表达,提示食管癌细胞NGAL转录调控区可能存在TPA应答元件.为了对食管癌细胞NGAL的这一TPA应答元件进行分段定位鉴定,首先将NGAL 5′侧翼区不同 长度片段－1 431～+84、－1 137～+84、－945～+84、－657～+84、－416～+84和－152～+84等依次插入质粒pGLP,构建NGAL/pGLP系列报告基因荧光素酶表达载体pGLP 1431、pGLP 1137、pGLP 945、pGLP 657、pGLP 416和pGLP 152;然后将上述质粒分别同pRL TK共转染食管癌细胞EC109,最后用5 ng/ml的TPA刺激转染的EC109,检测报告基因荧光素酶活力,综合判定报告基因荧光素酶活力变化趋势,并以此对食管癌细胞NGAL 5′侧翼区TPA应答元件进行分段定位.实验结果表明,食管癌细胞NGAL 5′侧翼－657～－417区段内存在着较强的TPA应答元件.生物信息学分析显示,NGAL 5′侧翼－657～－417区段至少存在3个潜在的TPA应答元件,表明有应答TPA刺激的结构基础.这些研究有助于从分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达机制.     

反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架的影响

为了研究反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞微丝骨架以及肿瘤细胞生物学行为的影响,以不同长度NGAL基因片段反义表达载体和硫代修饰反义寡核苷酸单链片段转染SHEEC食管癌细胞,通过G418筛选,建立一系列旨在封闭SHEEC食管癌细胞NGAL基因表达的亚细胞克隆.在细胞内F-肌动蛋白(F-actin)及DNA荧光双标记基础上,通过流式细胞术、激光共聚焦显微镜扫描术等技术手段检测封闭反义NGAL基因表达后, SHEEC食管癌细胞中F-actin和DNA含量、F-actin形态结构以及肿瘤细胞生物学行为的变化特征.结果显示,反义封闭NGAL基因表达后,SHEEC食管癌细胞F-actin的含量明显降低,与永生化食管上皮细胞SHEE相近,但细胞分裂增殖指数未见明显变化.表明反义封闭NGAL基因表达对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架有明显影响,而对SHEEC食管癌细胞的分裂增殖影响不明显.激光共聚焦显微镜扫描观测显示,反义封闭NGAL基因表达可使SHEEC食管癌细胞F-actin分布均匀,F-actin小体减少,细胞间连接重新建立,结构较紧密,主要形态结构特征与SHEE细胞趋于一致.提示反义封闭NGAL基因表达可对SHEEC食管癌细胞的微丝骨架F-actin产生明显影响,推测癌细胞的微丝骨架F-actin可能是NGAL基因在SHEEC食管癌细胞中发挥功能的一种作用环节.     

核基质网架蛋白可能是细胞凋亡中先于DNA的靶

1 .前言细胞凋亡是一种由遗传基因编码的主动的细胞死亡方式 ,是由Ｋｅｒｒ等[1] 人于 1 972年首先描述的。起初 ,人们所注重的是凋亡细胞形态学方面的改变。研究发现 ,在凋亡中染色质逐渐群集 ,进一步在广泛的区域内凝聚并显示边缘化特征。这些凝聚成分起初是贴近核膜的 ,然后在核的端部形成明显分界的杯状结构 ,并最终形成凋亡小体。长期以来这些特征性变化一直被作为细胞发生凋亡的主要指标。而随后在凋亡细胞中特征性梯形分布ＤＮＡ片段的发现曾一度使人们认为找到了一种能有效鉴别细胞凋亡的生物化学指标。这也自然而然地导致人们更多…     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的研究

以往研究发现,食管癌细胞的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)基因的过表达具有明显的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoyl phorboi-13-acetate,TPA)诱导性,在启动子-152～-60 区段存在着一种新型的TPA反应元件(TPA response element,TRE),但是该元件的结合蛋白尚未被鉴定出来.采用寡核苷酸DNA亲和层析法(oligonucleotide trapping)从食管癌细胞中分离纯化了NGAL基因TRE结合蛋白;经SDS-PAGE进一步分离,银染显示目标蛋白带.人工切取各目标蛋白带进行MALDI-TOF-MS分析,通过Mascot软件搜索NCBI数据库,根据蛋白质的功能、细胞定位和分子质量大小等指标确定8个核蛋白因子:C19、KIAA1949、TDRD1、RXRβ、FAM54A、KLF15、KLF10和YY-1.最后,利用RT-PCR验证了这些核蛋白因子表达的TPA反应性,结果表明C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β和KLF15等编码基因的转录表现出了明显的TPA反应性,提示可能是食管癌细胞中应答TPA刺激,参与NGAL基因过表达的转录激活因子.     

人食管癌cDNA酵母杂交文库的构建与鉴定及其应用

以往在研究由促癌物12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯（12-o-tetradecanoylphorbol-13 -acetate,TPA）诱导的人永生化食管上皮细胞恶性变中基因的差异表达情况时,曾获得中性粒细胞明胶酶相关lipocalin（neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）等新的食管癌癌变相关基因.为深入研究这些癌变相关基因在食管癌中以蛋白质-蛋白质或蛋白质-DNA相互作用为基础的功能网络调控关系,建立了一个食管癌cDNA酵母杂交文库.采用Trizol试剂从一种新的人食管癌细胞（SHEEC,由人永生化食管上皮细胞转化而来）中提取细胞总RNA,采用Oligotex mRNA Kit从细胞总RNA中制备PolyA⁺ mRNA,采用SuperScript^TM Choice System For cDNA Synthesis Kit合成cDNA,以PolyA⁺ mRNA为探针,化学发光法监测cDNA合成的质量,以pGADT₇为载体构建了SHEEC细胞的cDNA酵母杂交文库.文库的滴度为1.19×10⁹ cfu/ml,重组片段大小主要集中在0.5～6.0 kb,重组率为50％.在此基础上,应用酵母单杂交技术手段对该文库中的NF-κB元件结合因子进行了筛选,在SD/-his/-leu/［＋15 mmol/L 3-AT］缺陷培养基平板上共获得了约360个单克隆.按照平板上酵母单克隆直径的大小,选择直径大于2 mm者91个,提取质粒进行酶切鉴定和一对一酵母单杂交验证实验,结果获得了30个阳性重组子,并随机取其中的9个阳性重组子进行测序和GenBank/BLAST同源分析,发现某些基因编码的蛋白质产物在关键氨基酸残基位点上与p65和p50的NF-κB元件结合域公共序列具有高度一致性.这些实验结果表明,所构建的人食管癌cDNA酵母杂交文库是成功的.     

一氧化氮诱导食管癌细胞线粒体DNA编码基因过表达

以人食管癌细胞系EC109作为驱赶方（driver）,以被一氧化氮（nitric oxid,NO）诱导的EC109作为实验方（tester）,应用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)、反向mRNA斑点印迹和RNA印迹等技术手段研究了NO诱导的食管癌细胞中基因的过表达情况.然后对过表达基因的表达序列标签（expressed sequence tag,EST）实施序列测定,并与GenBank进行BLAST同源性比较和序列突变分析.结果先后两次从69个SSH阳性克隆中共鉴定出6个线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）编码的基因,即ND-4L、ND-4、COX-2、Lys-tRNA、ATP-8和ATP-6.表明NO可以诱导食管癌细胞mtDNA编码的基因过表达.另外,在ND-4L/ND-4基因的片段（10 736～11 449）上发现了三处同型单核苷酸置换（10 872 T→C, 11 001 A→G, 11 346 A→G）,在COX-2/Lys-tRNA/ATP-8/ATP-6基因片段（8 011～8 589）上发现了一处单核苷酸缺失（8 380 A）.氨基酸序列分析表明,在NO诱导的EC109中可能存在着一种结构异常的ATP-8肽链（一条在N端被截短的只有11个氨基酸残基的肽链,而正常的ATP-8肽链为68个氨基酸残基）.这些研究结果为深入揭示NO对肿瘤细胞的作用机制提供了新的重要线索.