食管癌细胞NGAL5′侧翼区存在TPA应答元件

在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中,NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)过表达,提示食管癌细胞NGAL转录调控区可能存在TPA应答元件.为了对食管癌细胞NGAL的这一TPA应答元件进行分段定位鉴定,首先将NGAL5′侧翼区不同长度片段-1 431~ 84-、1 137~ 84、-945~ 84、-657~ 84、-416~ 84和-152~ 84等依次插入质粒pGLP,构建NGAL/pGLP系列报告基因荧光素酶表达载体pGLP-1431、pGLP-1137、pGLP-945、pGLP-657、pGLP-416和pGLP-152;然后将上述质粒分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,最后用5 ng/ml的TPA刺激转染的EC109,检测报告基因荧光素酶活力,综合判定报告基因荧光素酶活力变化趋势,并以此对食管癌细胞NGAL5′侧翼区TPA应答元件进行分段定位.实验结果表明,食管癌细胞NGAL5′侧翼-657~-417区段内存在着较强的TPA应答元件.生物信息学分析显示,NGAL5′侧翼-657~-417区段至少存在3个潜在的TPA应答元件,表明有应答TPA刺激的结构基础.这些研究有助于从分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达机制.     

食管癌细胞NGAL基因－152 ～ －60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) 基因过表达,但过表达机制不明. 最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件. 为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL 5′ 侧翼区－152～+84、－140～+84、－78～+84、－59～+84、－50～+84、－41～+84、－37～+84、－29～+84和－10～+84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体. 将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL －152～+84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位. 结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于－152～－60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强. 生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型. 研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

食管癌细胞NGAL基因-152～-60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)基因过表达,但过表达机制不明.最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件.为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL5′侧翼区-152～ 84、-140～ 84、-78～ 84、-59～ 84、-50～ 84、-41～ 84、-37～ 84、-29～ 84和-10～ 84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体.将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL-152～ 84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位.结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于-152～-60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强.生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型.研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体（FXR）基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,－1　651～+200、－1　496～+200区域的启动子活性无明显区别,－847～+200区域的启动子活性最高,－544～+200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在－847～－544范围内.     

人NFBD1启动子的鉴定与初步分析

NFBD1,也称MDC1,是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为了进一步深入研究其转录调控机制,本研究克隆鉴定了NFBD1的启动子.首先应用5′ RACE技术鉴定了NFBD1的转录起始位点,首次发现NFBD1至少存在3种丰度和转录起始位点不同的转录变异体.然后,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了覆盖NFBD1基因5′侧翼区起始密码子ATG上游5 kb区域的一系列NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,NFBD1启动子区域定位于主要转录起始位点区域附近1.5 kb的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,NFBD1启动子缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和NF-Y等转录因子可能参与NFBD1的转录调控     

人PNRC基因启动子的初步鉴定

 PNRC (praline-rich nuclear receptor coactivator) 是最近发现的一种新的核受体辅活化子,它是以牛类固醇生成因子-1(SF1)作诱饵,利用酵母双杂系统从人乳腺cDNA表达文库中筛选得到的.为了研究人PNRC基因的表达调控机制,在对人PNRC基因的生物信息分析的基础上,采用5′RACE法确定了PNRC基因的转录起始位点,克隆了人PNRC基因的5′侧翼区,并对该区进行功能分析.分别构建了11种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒,将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果发现,PNRC的5′侧翼区的-323～+27、-323～+57-123～+57、-123～+27区域的启动子活性显著升高,其中-323～+27区域的启动子活性最高.研究表明,人PNRC基因启动子的最小区域位于PNRC的5′侧翼区的-123～+27区域. .     

NGAL基因新型TPA反应元件结合蛋白的研究

以往研究发现,食管癌细胞的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)基因的过表达具有明显的12-O-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯(12-O-tetradecanoyl phorboi-13-acetate,TPA)诱导性,在启动子-152～-60 区段存在着一种新型的TPA反应元件(TPA response element,TRE),但是该元件的结合蛋白尚未被鉴定出来.采用寡核苷酸DNA亲和层析法(oligonucleotide trapping)从食管癌细胞中分离纯化了NGAL基因TRE结合蛋白;经SDS-PAGE进一步分离,银染显示目标蛋白带.人工切取各目标蛋白带进行MALDI-TOF-MS分析,通过Mascot软件搜索NCBI数据库,根据蛋白质的功能、细胞定位和分子质量大小等指标确定8个核蛋白因子:C19、KIAA1949、TDRD1、RXRβ、FAM54A、KLF15、KLF10和YY-1.最后,利用RT-PCR验证了这些核蛋白因子表达的TPA反应性,结果表明C19、KIAA1949、TDRD1、RXR β和KLF15等编码基因的转录表现出了明显的TPA反应性,提示可能是食管癌细胞中应答TPA刺激,参与NGAL基因过表达的转录激活因子.     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因微卫星序列多态性分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)参与肌肉生长和脂肪发生的调节．本研究在克隆大黄鱼MSTN cDNA的基础上,对3′端非编码区微卫星序列的多态性及其与体长、体重和肌肉脂肪含量的关系进行了分析．结果表明,获得的cDNA长1 886 bp,在3′端非编码区存在微卫星序列（CA）_n．在受检的52个个体中,微卫星序列长度在64～126 bp之间.大部分个体的微卫星序列内存在碱基替换,最常见的碱基替换形式是C→T,属于非完美型微卫星序列．根据该位点微卫星序列长度,在实验群体中共检测到23个等位基因,其中频率为0.019 2的等位基因11个,0.038 5的5个, 0.076 9的3个,0.057 7的2个,0.115 4和0.134 6的各1个．该基因位点的群体杂合度为0.932 7,多态信息含量为0.928 8．微卫星序列长度与大黄鱼体长、体重和肌肉脂肪含量之间的相关系数分别为0.409、0.435和-0.026,P值分别为0.021、0.016和0.878．碱基替换对大黄鱼生长及肌肉脂肪含量均无显著影响．     

NF-κB决定小鼠胎肝激酶-1基因启动子的基本活性

为克隆小鼠胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1,FLK-1）基因上游启动子序列,并观察其不同截短片段在小鼠血管内皮细胞中的启动子活性,以小鼠全基因组为模板,通过PCR扩增方法获得-258～+299 bp、-96～+299 bp、-71～+299 bp、-36～+299 bp大小的FLK-1启动子片段,将其定向克隆入pGL3 Basic,构建荧光素酶报告基因载体,并制备NF -κB结合位点的突变或缺失体.在阳离子脂质体介导下,报告基因载体瞬时转染小鼠血管内皮细胞株SVEC 4-10.结果发现,在小鼠血管内皮细胞中,各FLK-1启动子片段均有活性;－71～－36 bp区存在FLK-1启动子的核心调控元件.针对该区域NF-κB结合位点进行突变或缺失,能导致启动子活性显著降低;凝胶电泳迁移率实验表明该区段能结合转录因子NF-κB.结果提示,成功克隆了在血管内皮细胞中具有活性的FLK-1上游启动子序列,NF-κB是决定其基本活性的重要转录因子,为进一步研究FLK-1基因的转录调控机制奠定了基础.     

纤维介素基因hfgl2启动子的SARS冠状病毒核心蛋白反应元件初步分析

 SARS冠状病毒核心蛋白对hfgl2纤维介素基因有激活作用,采用实时荧光定量PCR和Western印迹已验证了hfgl2基因在mRNA和蛋白水平的表达.为进一步明确在SARS冠状病毒核心蛋白刺激下,hfgl2纤维介素基因5′端非编码区对转录激活起重要作用的转录调控序列,构建了一系列hfgl2 基因启动子荧光素酶报告基因质粒,将其与SARS冠状病毒核心蛋白真核表达质粒共转染CHO细胞.结果表明,转染前3个质粒hfgl2p(－1334)LUC、hfgl2p(－997)LUC、hfgl2p(－816)LUC的细胞的相对荧光素酶活性无显著改变;但转染hfgl2p( 468)LUC 质粒的细胞荧光素酶的活性较前明显降低,说明在hfgl2 基因启动子－816位至－468位（相对于转录起始点）之间存在着激活该基因的调控序列.本研究在一定程度上从分子水平揭示了SARS冠状病毒蛋白与宿主纤维介素基因之间的关系.     

川西亚高山3个优势树种不同径级根系分解特征

采用埋袋法对川西亚高山3个优势树种(岷江冷杉、粗枝云杉和红桦)细根(≤2 mm)、中根(2～5 mm)和粗根(≥5 mm)质量损失率及碳(C)、氮(N)、磷(P)在经历生长季和非生长季之后释放特征进行研究.结果表明： 红桦质量残留率低于岷江冷杉和粗枝云杉.同一树种,质量残留率总体上随根系径级增加而增加.非生长季的质量损失率占全年质量损失率的52.1%～64.4%.红桦C释放率最高,岷江冷杉最低,且随根系直径的增粗,C释放率降低.岷江冷杉和粗枝云杉N释放模式为非生长季富集、生长季释放,而红桦反之.富集期间,径级越大,富集量越多.3个树种各径级根系P动态在非生长季和生长季皆表现为富集-释放模式,且岷江冷杉P富集程度显著高于粗枝云杉和红桦,但各径级之间差异总体不显著.根系径级对川西亚高山森林根系分解具有显著影响,而径级影响与树种和分解时期有一定关系.     

典型黑土区不同水土保持林表层土壤磷素形态及有效性

以典型黑土区人工营造的落叶松林、水曲柳林、樟子松林和美青杨林表层土壤(0～10 cm)为对象,研究不同类型水土保持林土壤磷素的形态和有效性.结果表明: 水曲柳林和美青杨林土壤全磷、速效磷和磷各组分含量均显著高于落叶松林和樟子松林;4种林地土壤磷主要以有机磷形式存在,并且中活性有机磷NaOH P_o含量最高,占土壤磷素总量的58.9%;对植物有效性相对较高的H₂O P_i和NaHCO₃ P含量较低,分别占土壤磷素总量的1.2%和6.6%;除NaHCO₃ P_o外,土壤中不同磷素形态之间以及磷各组分与土壤有机质、全磷和有效磷之间具有显著相关关系.表明研究区内阔叶林比针叶林能够显著地提高土壤磷的有效性.     

东北林区4个天然针叶树种单木生物量模型误差结构及可加性模型

基于276株实测生物量数据,构建了东北林区红松、臭冷杉、红皮云杉和兴安落叶松4个天然针叶树种总量及各分项生物量一元、二元可加性生物量模型.采用似然分析法判断总量及各分项生物量异速生长模型的误差结构(可加型或相乘型),而模型参数估计采用非线性似乎不相关回归模型方法.结果表明: 经似然分析法判断,4个天然树种总量及各分项生物量异速生长模型的误差结构都是相乘型的,对数转换的可加性生物量可以被选用.各树种可加性生物量模型的调整后确定系数R_a²为0.85～0.99,平均相对误差为-7.7%～5.5%,平均相对误差绝对值<30.5%.增加树高可以显著提高各树种可加性生物量模型的拟合效果和预测能力,而且总量、地上和树干生物量模型效果较好,树根、树枝、树叶和树冠生物量模型效果较差.所建立的可加性生物量模型的预测精度为77.0%～99.7%(平均92.3%),可以很好地预估东北林区天然红松、臭冷杉、红皮云杉和兴安落叶松的生物量.
     

不同饵料对魁蚶稚贝生长和存活的影响

在温度23.5～24.0 ℃和盐度29.5～30.0条件下,研究了球等鞭金藻、小球藻、牟氏角毛藻和新月菱形藻4种单细胞藻类单独及组合投喂24 d后对魁蚶稚贝生长与存活的影响.结果表明: 不同饵料投喂条件下,稚贝存活率均在95%以上,不同处理组间差异不显著.单一饵料投喂组中,球等鞭金藻组的稚贝生长最快,小球藻组的稚贝生长最慢.组合投喂组中,球等鞭金藻与其他3种单胞藻混合(1∶1)投喂组稚贝壳长及特定生长率均优于其他组,其中与小球藻混合投喂的效果最好,稚贝壳长和壳高的特定生长率分别为5.6%·d^-1和6.4 %·d^-1.研究结果可为魁蚶人工苗种培育技术的优化提供参考依据.
     

全反式维甲酸抑制猪脂肪间充质干细胞的成脂分化

分离培养猪脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells, AMSCs）,流式细胞仪鉴定其表面标记.利用MTT比色检测不同浓度的全反式维甲酸（all trans retinoic acid, ATRA）对猪AMSCs增殖的影响;光学显微镜下观察猪AMSCs向脂肪细胞分化的形态学变化;油红O染色提取法分析不同浓度ATRA对猪AMSCs成脂分化的影响;RT PCR检测脂肪细胞分化标志基因LPL和aP2 mRNA的变化.MTT比色结果显示,生理浓度（1×10^－9～1×10^－8 mol/L）和药理浓度（1×10^－7～1×10^－5 mol/L）ATRA对猪AMSCs增殖均没有影响.油红O染色提取法结果表明,除1×10^－7　mol/L ATRA对猪AMSCs成脂分化没有影响外,生理浓度（1×10^－9～1×10^－8 mol/L）和其它药理浓度（1×10^－6～1×10^－5 mol/L）ATRA均显著抑制猪AMSCs成脂分化（P<0.05）.RT-PCR检测显示,ATRA显著抑制脂肪细胞分化标志基因LPL和aP2 mRNA表达（P<0.05）.     

云南干热河谷印楝和大叶相思人工纯林与混交林养分循环特征

为了更好地指导干热河谷不同恢复模式下人工林经营过程中的养分管理以及造林模式的筛选,以元谋干热河谷10年生印楝和大叶相思为研究对象,对其纯林及混交林内N、P、K、Ca、Mg主要养分元素的积累、分配和循环进行研究.结果表明： 印楝纯林、大叶相思纯林及印楝+大叶相思混交林5种营养元素的总积累量分别为333.05、725.61和533.85 kg·hm^-2,印楝纯林各器官养分积累量为枝＞干＞根＞叶＞皮,大叶相思纯林与混交林均为枝＞干＞叶＞根＞皮.印楝纯林内5种养分元素的积累量为Ca＞K＞N＞Mg＞P,大叶相思纯林与混交林一致,均为Ca＞N＞K＞Mg＞P.林分养分年存留量为62.72～162.19 kg·hm^-2·a^-1,总归还量为48.82～88.86 kg·hm^-2·a^-1,年吸收量为111.54～251.05 kg·hm^-2·a^-1,均以大叶相思纯林最高,其次是混交林,印楝纯林最低.林分对营养元素的利用系数为0.34～0.39,循环系数为0.35～0.44,周转期为6.54～8.17 a.印楝纯林内N和P的归还量小,循环速率低;大叶相思纯林内N和P的循环速率较大,有利于林地养分的维持;混交林内养分吸收量和归还量为印楝纯林的186.2%和167.2%,N、P和K的循环速率大于印楝纯林,Ca的周转期短于大叶相思纯林的50%.印楝和大叶相思混交种植有利于林地土壤肥力的恢复和生产力的维持.
     

北方温带森林不同海拔梯度土壤碳矿化速率及酶动力学参数温度敏感性

采集长白山脉龙岗支脉老秃顶子南坡3个不同海拔梯度森林(岳桦林、针阔混交林、红松林)土壤,进行室内温度梯度培养试验,研究土壤碳矿化速率(C_min)和土壤β-1,4-葡萄糖苷酶(β_G)动力学参数及温度敏感性.结果表明： 海拔和温度对C_min均有显著影响,3种森林土壤C_min均随着培养温度升高而增加,且岳桦林土壤C_min最高.3种森林土壤碳矿化速率温度敏感性\[Q₁₀(C_min)\]大小为岳桦林>红松林>针阔混交林,但差异不显著.3种森林土壤β_G动力学参数最大反应速率(V_max)和米氏常数(K_m)均随培养温度升高而增加,V_max的温度敏感性\[Q₁₀(V_max)\]为1.78～1.90,K_m的温度敏感性\[Q₁₀(K_m)\]为1.79～2.00.岳桦林Q₁₀(V_max)/Q₁₀(K_m)值显著高于红松林和针阔混交林,表明高海拔岳桦林土壤有机碳水解酶动力学参数受温度升高影响最大.     

外源Ca2+对水杨酸诱导番茄抗灰霉病的增效机制

探讨了外源Ca²⁺对水杨酸(SA)诱导番茄抗灰霉病的增效机制.以番茄灰霉病敏感型品种‘L402’幼苗为材料,分别进行H₂O(对照)、SA、SA+Ca和SA+EGTA(Ca²⁺螯合剂)处理,期间(1～5 d)分析各处理植株叶片活性氧(ROS)含量,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及病程相关蛋白编码基因PR1、PR2和PR3表达水平的变化,并调查处理3 d后灰霉病情指数.结果表明： 与对照(病情指数为74.8)相比,SA、SA+Ca和SA+EGTA处理的植株叶片灰霉病的病情指数分别为46.9、38.5和70.3;SA处理明显提高叶片ROS含量以及苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,这些参数在SA+Ca处理的植株中被进一步提高,但在SA+EGTA处理的植株中则被降低;SA处理明显提高了PR1、PR2a和PR3b的表达水平,Ca²⁺进一步加强了这一效果,而EGTA则起抑制作用.SA或SA+Ca处理期间的PR2b和PR3a表达较未处理的对照上调了1～2倍,而PR1、PR2a和PR3b上调了2～5倍.表明Ca²⁺对SA诱导番茄抗灰霉病具有增效作用,其机理至少与Ca²⁺和SA协同作用促进ROS形成有关,而ROS作为信号分子增加植株抗病相关酶活性以及PR1、PR2a和PR3b等防卫基因的表达.     

外源Ca2+对水杨酸诱导番茄抗灰霉病的增效机制

探讨了外源Ca²⁺对水杨酸(SA)诱导番茄抗灰霉病的增效机制.以番茄灰霉病敏感型品种‘L402’幼苗为材料,分别进行H₂O(对照)、SA、SA+Ca和SA+EGTA(Ca²⁺螯合剂)处理,期间(1～5 d)分析各处理植株叶片活性氧(ROS)含量,苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,以及病程相关蛋白编码基因PR1、PR2和PR3表达水平的变化,并调查处理3 d后灰霉病情指数.结果表明： 与对照(病情指数为74.8)相比,SA、SA+Ca和SA+EGTA处理的植株叶片灰霉病的病情指数分别为46.9、38.5和70.3;SA处理明显提高叶片ROS含量以及苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性,这些参数在SA+Ca处理的植株中被进一步提高,但在SA+EGTA处理的植株中则被降低;SA处理明显提高了PR1、PR2a和PR3b的表达水平,Ca²⁺进一步加强了这一效果,而EGTA则起抑制作用.SA或SA+Ca处理期间的PR2b和PR3a表达较未处理的对照上调了1～2倍,而PR1、PR2a和PR3b上调了2～5倍.表明Ca²⁺对SA诱导番茄抗灰霉病具有增效作用,其机理至少与Ca²⁺和SA协同作用促进ROS形成有关,而ROS作为信号分子增加植株抗病相关酶活性以及PR1、PR2a和PR3b等防卫基因的表达.