食管癌细胞NGAL基因－152 ～ －60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) 基因过表达,但过表达机制不明. 最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件. 为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL 5′ 侧翼区－152～+84、－140～+84、－78～+84、－59～+84、－50～+84、－41～+84、－37～+84、－29～+84和－10～+84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体. 将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL －152～+84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位. 结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于－152～－60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强. 生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型. 研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

食管癌细胞NGAL基因-152～-60区段存在TPA反应元件

以往研究发现,在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophilgelatinase-associatedlipocalin,NGAL)基因过表达,但过表达机制不明.最近研究提示,食管癌细胞NGAL启动子及其邻近区域可能存在着TPA反应元件.为了对NGAL的这一TPA反应元件进行更准确定位,采用PCR法结合嵌套缺失实验从食管癌细胞中克隆了NGAL5′侧翼区-152～ 84、-140～ 84、-78～ 84、-59～ 84、-50～ 84、-41～ 84、-37～ 84、-29～ 84和-10～ 84等片段,并定向插入pGLB、pGLP或pGLE等萤火虫荧光素酶报告基因表达载体中,构建了pGLB-152、pGLP-152、pGLE-152、pGLB-140、pGLB-78、pGLB-59、pGLB-50、pGLB-41、pGLB-37、pGLB-29和pGLB-10等系列报告基因表达载体.将上述报告基因表达载体分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,并用TPA刺激,检测TPA刺激转染EC109的相对荧光素酶活力,综合判定NGAL-152～ 84区不同长度片段的TPA反应性,对NGAL启动子区的TPA反应元件给予进一步分段定位.结果表明,NGAL启动子区的TPA反应元件位于-152～-60区段,而且应答TPA刺激的反应能力很强.生物信息学分析结果显示,NGAL启动子区所存在的TPA反应元件很可能是一种新结构类型.研究说明,NGAL在DNA序列上有应答TPA刺激的结构基础,将有助于深入到分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL过表达机制,也有助于进一步认识TPA信号细胞内传递途径网络在肿瘤发生发展中的作用.     

食管癌细胞NGAL5′侧翼区存在TPA应答元件

在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中,NGAL(neutrophil gelatinase associated lipocalin)过表达,提示食管癌细胞NGAL转录调控区可能存在TPA应答元件.为了对食管癌细胞NGAL的这一TPA应答元件进行分段定位鉴定,首先将NGAL 5′侧翼区不同 长度片段－1 431～+84、－1 137～+84、－945～+84、－657～+84、－416～+84和－152～+84等依次插入质粒pGLP,构建NGAL/pGLP系列报告基因荧光素酶表达载体pGLP 1431、pGLP 1137、pGLP 945、pGLP 657、pGLP 416和pGLP 152;然后将上述质粒分别同pRL TK共转染食管癌细胞EC109,最后用5 ng/ml的TPA刺激转染的EC109,检测报告基因荧光素酶活力,综合判定报告基因荧光素酶活力变化趋势,并以此对食管癌细胞NGAL 5′侧翼区TPA应答元件进行分段定位.实验结果表明,食管癌细胞NGAL 5′侧翼－657～－417区段内存在着较强的TPA应答元件.生物信息学分析显示,NGAL 5′侧翼－657～－417区段至少存在3个潜在的TPA应答元件,表明有应答TPA刺激的结构基础.这些研究有助于从分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达机制.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚.为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58).其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性.最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1(由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体)分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达.研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点(-75/-69)和AP-1结合位点(-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要.     

肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的顺式作用元件及转录因子的鉴定

研究发现,质膜-细胞骨架连接蛋白Ezrin在多种肿瘤细胞中异常表达,而且Ezrin的表达上调与肿瘤细胞的移动侵袭相关,但是调控ezrin基因转录的分子机制却不清楚．为了探明ezrin基因的转录调控机制,以肺癌细胞A549为材料,首先采用双荧光素酶报告基因分析系统检测ezrin基因5′侧翼嵌套缺失序列和位点突变序列的转录活性,鉴定肺癌细胞中ezrin基因的基本启动子区以及关键的顺式作用元件Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58)．其次,利用凝胶电泳迁移率变动分析证明,肺癌细胞核蛋白提取物能够与ezrin基因含有关键顺式作用元件的DNA序列结合,形成DNA-核蛋白复合物,而且Sp1结合位点和AP-1结合位点与重组蛋白rhSp1和rhAP-1的结合具有位点特异性．最后,利用瞬时转染实验证实,转录因子Sp1和AP-1 (由c-Jun和c-Fos组成的异源二聚体) 分别通过Sp1结合位点和AP-1结合位点,增强ezrin基因基本转录活性,而且,过表达转录因子Sp1、c-Jun或c-Fos上调了Ezrin蛋白表达．研究确定,肺癌细胞中调控ezrin基因基本转录活性的关键顺式作用元件是Sp1结合位点 (-75/-69) 和AP-1结合位点 (-64/-58),与之作用的转录因子Sp1和AP-1对于ezrin基因的转录激活作用至关重要．     

食管癌细胞NGAL5′侧翼区存在TPA应答元件

在TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中,NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)过表达,提示食管癌细胞NGAL转录调控区可能存在TPA应答元件.为了对食管癌细胞NGAL的这一TPA应答元件进行分段定位鉴定,首先将NGAL5′侧翼区不同长度片段-1 431~ 84-、1 137~ 84、-945~ 84、-657~ 84、-416~ 84和-152~ 84等依次插入质粒pGLP,构建NGAL/pGLP系列报告基因荧光素酶表达载体pGLP-1431、pGLP-1137、pGLP-945、pGLP-657、pGLP-416和pGLP-152;然后将上述质粒分别同pRL-TK共转染食管癌细胞EC109,最后用5 ng/ml的TPA刺激转染的EC109,检测报告基因荧光素酶活力,综合判定报告基因荧光素酶活力变化趋势,并以此对食管癌细胞NGAL5′侧翼区TPA应答元件进行分段定位.实验结果表明,食管癌细胞NGAL5′侧翼-657~-417区段内存在着较强的TPA应答元件.生物信息学分析显示,NGAL5′侧翼-657~-417区段至少存在3个潜在的TPA应答元件,表明有应答TPA刺激的结构基础.这些研究有助于从分子水平揭示TPA诱导永生化食管上皮细胞癌变中NGAL基因过表达机制.