猪水泡病病毒全基因组核苷酸序列的测定与分析

猪水泡病是由猪水泡病病毒(Swine vesicular disease virus,SVDV)引起的猪的一种急性传染病,在症状上与口蹄疫极其相似。该病流行性强,发病率高,能造成严重的公共卫生问题。国际兽医局将其列为动物A类传染病,我国农业部列为动物一类传染病。SVDV属于小RNA病毒科肠道病毒属,其核酸类型为单股正链RNA分子,无囊膜,病毒基因组含一个大的开放阅读框,编码一条由2185个氨基酸组成的多聚蛋白。     

腺病毒载体在基因治疗和疫苗研究中的应用

自从二十世纪五十年代开始认识腺病毒（Adenovirus）以来,对腺病毒的生物学和免疫学特征已经有比较多的认识。腺病毒科包括禽腺病毒属（Aviadenovius）和哺乳动物腺病毒（Mastadenov irus）两个属。除人腺病毒以外,一些哺乳动物的腺病毒和禽腺病毒也成为基因治疗和载体疫苗研究的热点,如猪腺病毒3型（PAV-3）、牛腺病毒3型（BAV-3）、绵羊腺病毒（Ovine adenovirus,OAV）、禽腺病毒（Aviadenovirus）、犬腺病毒（Canine adeno virus,CAV）和黑猩猩腺病毒（Chimpanzee adenovirus）。不同种属的腺病毒虽然基因组序列完全不同,但其结构和功能却非常相似,而且各型腺病毒之间很少有交叉免疫反应,这就为利用这些腺病毒研制基因治疗载体和活载体疫苗提供了丰富的材料。近年来的研究也发现,如果利用一种腺病毒载体来进行重复免疫,宿主针对腺病毒载体蛋白的免疫反应比较强大,造成转基因表达时间缩短,重复免疫的效果较差,换用不同的病毒载体,则可以回避这种免疫反应,提高转基因的表达时间和保护性免疫反应。腺病毒可以感染很多分裂期或静止期细胞,即使在一些高度分化的组织细胞中也可增殖,如可有效的感染肌肉组织、心、肺和脑组织,并能高效的复制、表达其基因产物,因此腺病毒成为基因治疗和活病毒载体疫苗研究的首选工具。     

3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建

【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。     

三种大肠杆菌表达的口蹄疫病毒A型多表位蛋白对猪的免疫原性比较

【目的】研制猪口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)A型多表位蛋白疫苗,为猪FMDV A型的防控提供安全有效的疫苗。【方法】根据前期试验结果及国内外FMDVA型流行病学信息,设计并合成了3种多表位免疫原基因A10、IA10和FA10。在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达蛋白纯化复性后,制苗免疫猪。分别于免疫前和免疫后14和28d采血分离血清,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)方法检测血清IgG抗体滴度。免疫28d后用FMDV强毒攻毒,以评估免疫保护效果。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果证实A10、IA10和FA10三种蛋白均获得表达,分子量分别为35、57和64 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被FMDV感染阳性血清所识别。LPB-ELISA结果表明,A10+201免疫组IgG滴度低于灭活疫苗组,但高于其他免疫组。攻毒后A10+201免疫组和灭活疫苗免疫组全部猪(5/5)获得保护,IA10+201和FA10+201免疫组80%(4/5)猪保护,A10和FA10免疫组只有20%(1/5)猪保护,而PBS+201组所有猪均未保护。【结论】A10+201免疫保护效果较好,可作为候选疫苗进行进一步评价。     

RNAi及其抑制口蹄疫病毒复制的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double strand RNA,dsRNA)介导的序列特异的RNA降解过程。已经证明,在植物和昆虫细胞中RNAi是其主要的抗病毒免疫机制,至今为止几乎没有发现在病毒感染哺乳动物细胞过程中诱发有效的抗病毒RNAi反应。因此,人们希望能够利用人工方法在哺乳动物细胞中建立有效的抗病毒RNAi防御策略。迄今为止,对多种哺乳动物病毒的研究结果令人振奋。主要围绕RNAi的分子基础、基本策略及其在抑制口蹄疫病毒复制中的研究现状作了综述。     

一种新型T细胞免疫原的原核表达及对口蹄疫疫苗的免疫增强作用

主要探讨了T细胞免疫原TI对口蹄疫疫苗的免疫增强作用。设计并原核表达产生了一种包含口蹄疫病毒VP1,VP4,3A和3D蛋白上多个T细胞表位与两个通用T细胞表位的T细胞免疫原,命名为TI;同时表达了O和Asia 1两个型口蹄疫病毒 VP1 蛋白的串联编码基因,表达产物命名为OA-VP1。将上述T细胞免疫原分别与OA-VP1和口蹄疫灭活疫苗按不同剂量组合免疫小鼠,于免疫后不同时间测定各组小鼠的体液与细胞免疫应答情况。采用微量中和试验检测小鼠O型和Asia1型中和抗体,采用流式细胞检测技术和测定γ-干扰素的水平来分析不同免疫组小鼠细胞免疫的水平。结果显示,与灭活疫苗或OA-VP1单独免疫组相比,添加TI抗原后灭活疫苗 (P＜0.01) 和OA-VP1免疫组(P＜0.05)小鼠均能产生高水平的特异性中和抗体;且CD4+ T细胞数量显著增多,IFN-γ产生水平显著升高 (P＜0.01)。说明TI抗原具有很好的诱导特异性体液与细胞免疫应答的作用,是一种很好的免疫增效剂,可作为口蹄疫蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗中的一种有效成分,以提高疫苗的免疫效果。     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P1—2A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质粒用PmeI线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy—1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—p12x3c和pAdcmy—p12x3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行。PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒C株兔脾毒在SK6细胞中的增殖培养及其鉴定

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), direct florescent antibody staining, and RT-PCT were used to detect growth characteristics of Cassical swine fever virus C-strain (Derived from Spleen) in SK6 cell. The results indicated than C-strain (Derived from Spleen) can grow in SK6 cell at a lower level. Direct florescent antibody staining method was not suitable for the detection of attenuated lapinized C-strain. The study provided a primary guide for the detection of attenuated classical swine fever virus. It also supplies an elementary foundation for the study of its growth characteristic in SK6.     

FMDV非结构蛋白2C主要表位区与3AB基因的组合表达与活性分析

近年的研究表明, 口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面具有潜在的价值, 为了建立敏感性更高的鉴别诊断方法, 将截取了2C蛋白N-端和C-端的主要B细胞表位区和完整3AB蛋白基因组合后, 进行了原核表达, 得到了分子量约为47.6 kD的目的蛋白2C￠3AB。通过Western blotting分析证明, 表达产物能被FMDV感染动物阳性血清识别, 具有很好的反应性。以通过电泳纯化的目的蛋白作抗原进行间接ELISA检测不同来源的动物血清, 结果表明, 该抗原仅与感染动物血清具有很好的反应活性, 而与健康动物与免疫动物血清无反应, 说明重组蛋白2C￠3AB可作为区分灭活疫苗免疫动物与感染动物的鉴别诊断抗原。用2C￠3AB和3ABC为抗原进行间接ELISA, 对比检测田间血清样品, 结果显示2C￠3AB-ELISA敏感性比3ABC-ELISA高。说明以重组蛋白2C￠3AB作为鉴别诊断抗原, 能进一步提高对临界值血清的检出率, 这对区分灭活疫苗免疫动物与FMDV隐性感染动物与带毒动物具有非常重要的意义。     

杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中表达的研究进展

杆状病毒(Baculovirus)是一种以昆虫为唯一宿主的病毒, 可用做生物杀虫剂或作为表达载体在昆虫细胞中大量表达外源蛋白, 制备疫苗。研究发现, 在哺乳动物细胞中携带哺乳动物启动子的重组杆状病毒能启动下游外源基因的表达但病毒不能在哺乳动物细胞中增值, 对细胞毒性小, 转导成功的细胞可以稳定传代并有效表达外源基因, 哺乳动物细胞比昆虫细胞对蛋白质具有更好的翻译后修饰, 表达出的蛋白结构更接近天然蛋白。因此, 杆状病毒可作为一种新型的哺乳动物细胞基因转移载体, 用于表达外源基因及作为一种基因治疗载体, 具有巨大潜力, 日益受到人们的关注。本文对杆状病毒作为一种表达载体在哺乳动物细胞中表达的研究进展进行了综述。