不同黏膜佐剂对猪丁型冠状病毒诱导小鼠免疫应答的影响

【目的】旨在为猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)灭活疫苗黏膜免疫筛选理想佐剂,降低疫苗副作用。利用小鼠模型评价不同佐剂制备的PDCoV灭活疫苗对体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答的影响。【方法】将甘露聚糖肽(PA)、CpGODN2395、单磷酰脂质A(MPLA)佐剂分别与IMS 1313、GEL02佐剂联合制备PDCoV灭活疫苗,经鼻腔免疫BALB/c小鼠;将ISA201佐剂制备的PDCoV灭活疫苗经皮下免疫BALB/c小鼠,将PDCoV灭活抗原经鼻腔免疫BALB/c小鼠作为对照,间隔14 d加强免疫一次。用ELISA方法检测小鼠血清、支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IgG、IgG1、IgG2a、IL-4、IFN-γ及粪便和BALF中sIgA表达水平;用MTT方法检测疫苗免疫后对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;观察并记录小鼠免疫后的临床表现,HE染色方法观察免疫小鼠主要器官组织的病理学变化,评价疫苗的安全性。【结果】ISA201组小鼠BALF和血清中的抗体(IgG、IgG1)及IL-4表达水平相对较高,但IgG2a、IFN-γ和粪便中sIgA表达水平...     

副猪嗜血杆菌血清4、13和14型TbpA对豚鼠的交互免疫保护性

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Gl?sser?sdisease)的病原体,目前在对该病的防控中,由于长期使用抗生素产生的耐药性以及灭活疫苗缺乏交互免疫保护力,亟待寻求新的方法来解决这一问题。【目的】探究不同血清型HPS转铁结合蛋白A (TbpA)对豚鼠的交互免疫保护性,为进一步用仔猪开展相关研究奠定基础。【方法】采用HPS血清型4、13和14型重组TbpA以0.1mg/只、经2次间隔期为20d的免疫后,检测豚鼠血清IgG抗体和细胞因子(IL-2、IL-5、IL-8、IFN-γ、MCP-1、TNF-α)水平;以HPS血清型4、13和14型菌株5 LD50剂量腹腔攻毒,检查病理组织学变化及其免疫保护率。【结果】HPS血清型4、13和14型重组TbpA均能诱导豚鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使细胞因子显著升高。HPS血清型4、13和14型重组TbpA在免疫后均能对豚鼠产生交互免疫保护,其中HPS血清型13型TbpA免疫组的交互免疫保护率最高,对血清型4、14型HPS均为50.0%,对相同血清型HPS的免疫保护率也最高,达到83.3%,病理组织学检查显示与HPS血清型4、14型TbpA免疫组相比,13型TbpA免疫组的组织切片病理变化与攻毒对照组之间差异更明显。【结论】HPS血清型4、13和14型TbpA均能诱导豚鼠的体液免疫和相关细胞因子的分泌,产生交互免疫保护力,其中HPS血清型13型Tbp A的交互免疫保护力最强,可作为一种新的疫苗候选抗原。     

重组鸡痘病毒和DNA疫苗对口蹄疫病毒的豚鼠免疫保护

将构建的携带FMDV衣壳蛋白P1-2A和蛋白酶3C编码基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1以及编码FMDV P1-2A基因和猪IL-18基因的重组DNA疫苗pVIRIL18P1,分别以单独和混合的方式给豚鼠进行2次免疫,然后测定FMDV特异性结合抗体、中和抗体和T淋巴细胞增殖反应,并用250 ID50的FMDV进行攻击,观察其保护效果.结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导豚鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答.其中以vUTAL3CP1两次免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规灭活疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多.攻击保护结果表明该组完全保护率可达3/4,而另外两组也具有一定保护效果.上述研究结果为进一步进行大动物免疫攻毒试验,并最终筛选出最佳疫苗和免疫程序奠定了基础.     

重组鸡痘病毒和DNA疫苗对口蹄疫病毒的豚鼠免疫保护

将构建的携带FMDV衣壳蛋白P1-2A和蛋白酶3C编码基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1以及编码FMDVP1-2A基因和猪IL-18基因的重组DNA疫苗pVIRIL18P1,分别以单独和混合的方式给豚鼠进行2次免疫,然后测定FMDV特异性结合抗体、中和抗体和T淋巴细胞增殖反应,并用250ID50的FMDV进行攻击,观察其保护效果。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导豚鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以vUTAL3CP1两次免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规灭活疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。攻击保护结果表明该组完全保护率可达3/4,而另外两组也具有一定保护效果。上述研究结果为进一步进行大动物免疫攻毒试验,并最终筛选出最佳疫苗和免疫程序奠定了基础。     

牛布鲁氏菌A19突变株的构建及在BALB/c鼠中的免疫保护评估北大核心CSCD

【目的】构建牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株并免疫BALB/c鼠,初步评估了其免疫保护效果。【方法】应用PCR方法扩增A19疫苗株VirB12基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pBK-CMV-SacBVirB12,将该质粒电击转化至布鲁氏菌A19感受态细胞中,筛选得到布鲁氏菌疫苗株A19的VirB12基因缺失株。以A19疫苗株为参照,应用A19-ΔVirB12疫苗接种BALB/c小鼠,免疫45d后布鲁氏菌2308强毒株攻毒,攻毒15d后取BALB/c鼠的脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。Western-blotting鉴定VirB12蛋白的免疫反应性。【结果】构建了牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株,小鼠免疫攻毒后15d,A19-ΔVirB12免疫组和A19免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P<0.05)。A19免疫组与A19-ΔVirB12免疫组之间克脾指数差异不显著(P>0.05)。Western blotting实验表明VirB12蛋白具有免疫反应性。【结论】牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株与亲本株A19免疫保护性无明显差异,通过血清学方法可区分疫苗免疫与野生型牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)感染动物,具备作为标记疫苗的潜力。     

A型口蹄疫合成肽疫苗的免疫效力评价

【目的】研制A型口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)新型合成肽疫苗,为畜牧业减少经济损失。【方法】应用两种含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)AF/72株VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35]和3B[29-42]4个抗原表位的合成肽联合CpG寡聚脱氧核苷酸(5’-TCGCGAACGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3’)在豚鼠上进行了免疫效力评价。【结果】2.5μg/只的合成肽364能保护4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻击,灭活苗组获得完全保护,其他组的保护效力仅为3/5;保护效力最高的两组的外周血CD4+T淋巴细胞含量高达33.7%和36.6%,而其他组不超过27.7%,PBS组仅为18.1%。【结论】本研究筛选出一组免疫效力较好的口蹄疫A型合成肽疫苗,可以作为候选疫苗进行进一步评价。     

猪脾转移因子对La Sota株鸡新城疫弱毒疫苗的免疫增强作用

【目的】本文旨在研究猪脾转移因子（TF）对新城疫（ND）病毒弱毒疫苗La Sota株的免疫增强作用及机理,为兽医临床防控提供理论依据。【方法】以4种不同剂量La Sota疫苗株分别单独、与TF联合免疫SPF鸡,14 d后以ND病毒（NDV）参考强毒F₄₈E₉株(10^4.7 ELD₅₀)进行攻毒,采用蛋白质芯片技术测定鸡外周血IL-6、IL-10、IL-16和IL-21浓度,并以血凝抑制（HI）试验和荧光定量RT-PCR方法分别检测鸡ND HI抗体效价和F₄₈E₉株的病毒血症水平。【结果】攻毒保护试验表明,单独免疫10^5.17、10^4.17、10^3.17和10^2.17 EID₅₀剂量时疫苗攻毒保护率分别为100%、55%、0%和0%,半数保护量(PD₅₀)为12 023 EID₅₀;对应剂量联合免疫时疫苗攻...     

禽多杀性巴氏杆菌粘附蛋白Cp39的交叉免疫保护作用

【目的】比较体内外增殖禽多杀性巴氏杆菌荚膜蛋白、天然粘附蛋白Cp39和重组粘附蛋白rCp39对小鼠的交叉保护作用。【方法】用NaCl提取法制备鸡胚尿囊液和DSA培养基增殖的C48-3株荚膜蛋白,并用电洗脱方法纯化Cp39蛋白,将rCp39蛋白以可溶形式表达在大肠杆菌BL21后,用Amylose Resin亲和层析柱纯化。分别以100μg剂量的鸡胚尿囊液增殖菌体荚膜蛋白、DSA培养基培养菌体荚膜蛋白、纯化的Cp39蛋白和rCp39蛋白通过皮下注射各试验组小鼠,生理盐水为对照组,第二次免疫后2周分别以A:1型菌C48-3株(6.7×102cfu)和A:3型菌C51-3株(1.1×103cfu)进行攻毒试验。采集免疫后小鼠血清,用ELISA法检测抗体水平,并计算免疫保护率,来评价4种抗原对小鼠的交叉保护效果。【结果】SDS-PAGE结果显示,体内外增殖禽多杀性巴氏杆菌荚膜蛋白的条带和分子量相似,且体内外表达的Cp39蛋白的分子量相同;ELISA结果表明Cp39免疫组小鼠和rCp39免疫组小鼠血清rCp39蛋白特异性抗体的水平显著高于其他两组(P0.05);保护试验表明,体外增殖菌体荚膜蛋白免疫组小鼠对同源C48-3株和异源C51-3株攻毒的保护率分别为100%和60%,鸡胚尿囊液增殖菌体荚膜蛋白免疫组小鼠、Cp39免疫组小鼠和rCp39免疫组小鼠对同源C48-3株和异源C51-3株攻毒的保护率分别为100%和80%。【结论】粘附蛋白Cp39是禽多杀性巴氏杆菌荚膜蛋白中的主要交叉保护抗原,可以作为禽霍乱亚单位疫苗。     

鸭疫里默氏菌DnaK、OmpA和OmpA-DnaK蛋白的免疫原性

【背景】鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)可引起鸭等多种禽类败血症和浆膜炎,给禽养殖业造成严重经济损失。蛋白疫苗是预防RA感染的重要策略之一。目前,有关RA重组蛋白免疫原性报道较少,且其应用也受到单一蛋白抗原诱导的特异性免疫反应不足的限制。【目的】探究分子伴侣DnaK、外膜蛋白A (outer membrane protein A,OmpA)和OmpA-DnaK蛋白疫苗在鸭体内诱导的免疫应答,评估其免疫原性,为RA疫苗抗原研发提供依据。【方法】克隆DnaK和OmpA基因并分别与pET-32a(+)载体相连,利用限制性酶切位点Nco I和Bam H I将OmpA连接至DnaK基因上游,经原核表达和纯化制得重组蛋白DnaK、OmpA和OmpA-DnaK。3种重组蛋白分别皮下免疫雏鸭2次,检测其血清抗体滴度、淋巴细胞增殖和细胞因子(IL-2和IL-4)水平;以RA-GH5肌肉注射攻毒,检查其组织病理学变化及免疫保护率。【结果】成功表达了DnaK、OmpA和OmpA-DnaK重组蛋白,分子量分别约为90、60和130 kDa。3种蛋白疫苗均能诱导宿主产生体液...     

ISA 61 VG佐剂增强单核细胞增生李斯特氏菌灭活疫苗的保护性免疫应答

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)是重要的人兽共患李斯特氏菌病的致病菌,疫苗免疫是预防该病原菌感染的有效手段之一。本研究研制了添加矿物油佐剂MontanideTM ISA61VG的新型灭活细菌疫苗,并对其安全性和免疫应答特性进行了研究。结果表明,ISA 61 VG佐剂疫苗具有较好的安全性;诱导小鼠产生的抗李斯特氏菌溶血素O抗体滴度以及IgG2a/IgG1比值显著高于无佐剂免疫组;在致死剂量Lm攻毒下,能对小鼠提供100%的免疫保护。因此,ISA 61VG佐剂能显著增强灭活疫苗诱导宿主产生体液免疫和细胞免疫应答的能力,从而提高灭活疫苗的保护性免疫应答作用,是预防人和动物Lm感染的潜在疫苗候选株。     

Chimeric virus-like particles elicit protective immunity against serotype O foot-and-mouth disease virus in guinea pigs

Foot-and-mouth disease (FMD) is an acute and highly contagious disease caused by foot-and-mouth disease virus (FMDV) that can affect cloven-hoofed animal species, leading to severe economic losses worldwide. Therefore, the development of a safe and effective new vaccine to prevent and control FMD is both urgent and necessary. In this study, we developed a chimeric virus-like particle (VLP) vaccine candidate for serotype O FMDV and evaluated its protective immunity in guinea pigs. Chimeric VLPs were formed by the antigenic structural protein VP1 from serotype O and segments of the viral capsid proteins (VP2, VP3, and VP4) from serotype A. The chimeric VLPs elicited significant humoral and cellular immune responses with a higher level of anti-FMDV antibodies and cytokines than the control group. Furthermore, four of the five guinea pigs vaccinated with the chimeric VLPs were completely protected against challenge with 100 50% guinea pig infectious doses (GPID₅₀) of the virulent FMDV strain O/MAY98. These data suggest that chimeric VLPs are potential candidates for the development of new vaccines against FMDV.     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍外源标签的能力

【目的】利用口蹄疫病毒的反向遗传操作技术,构建含不同外源标签口蹄疫病毒的全长克隆,鉴定口蹄疫病毒结构蛋白VP1容忍不同外源标签的能力。【方法】通过融合PCR技术,在FMDV O/HN/93全长感染性克隆的VP1 G-H环分别引入V5、TC12、KT3、3FLAG外源标签,构建全长质粒。全长质粒经Not I线化后转染表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞,拯救重组病毒。RT-PCR、序列测定、间接免疫荧光鉴定病毒,噬斑和一步生长曲线分析重组病毒的生物学特性。【结果】成功拯救到表达V5或KT3表位标签的重组病毒,未能拯救到表达TC12或3×FLAG的重组病毒。V5和KT3表位标签的插入均影响了口蹄疫病毒的复制能力。【结论】重组口蹄疫病毒的成功拯救为未来标记疫苗以及口蹄疫病毒作为表达载体等的研究奠定了基础。     

The Effect of Bovine IFN-α on the Immune Response in Guinea Pigs Vaccinatedwith DNA Vaccine of Foot-and-Mouth Disease Virus

Foot-and-mouth disease virus (FMDV) belongs to thegenus Aphthovirus of the family Picornavidae. The FMDVgenome is a copy of positive-sense, single-stranded RNA,which contains one large open reading frame (ORF). TheORF is translated into a polypeptide, which undergoesautoproteolytic cleavage to produce the structural and non-structural proteins and ultimately forms mature viral pro-teins [1,2]. FMD is caused by the FMDV, which is a highly conta-gious vesicular disease of cloven-hoofe…     

Recombinant Bivalent Vaccine against Foot-and-Mouth Disease VirusSerotype O／A Infection in Guinea Pig

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagiousdisease of cloven-hoofed animals such as cattle and pig.The disease causes explosive epidemics and heavyeconomic losses in the agriculture worldwide [1]. FMDvirus (FMDV) shows a high genetic and antigenicvariability, and has seven serotypes: O, A, C, AsiaI, SAT1,SAT2 and SAT3 [2]. The FMDV control is mainly imple-mented using chemically inactivated virus vaccines, whichmay contain residual living virus and pose a risk of virusreleas…     

VP3 G–H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响

【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHN~(V3174Y)和rHN~(D3173N+V3174E+N3179C)。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID_(50)和LD_(50)的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHN~(V3174Y)和rHN~(D3173N+V3174E+N3179C)对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHN~(V3174Y)和rHN~(D3173N+V3174E+N3179C)对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G–H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。     

3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建

【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。     

2017–2022年中国口蹄疫流行状况分析

【目的】分析近年来中国口蹄疫流行和传播特点,研判口蹄疫流行趋势。【方法】以2017-2022年间中国报告发生的口蹄疫疫情为研究对象,从疫情的“三间分布”、生产环节分布、流行毒株分子流行病学分析及溯源等方面,对近6年的疫情情况进行系统梳理。【结果】2017-2022年间中国共有15个省份报告发生口蹄疫疫情54次。总体形势稳定：Asia 1型口蹄疫维持无疫状态;2019-2022年连续4年未发生A型口蹄疫疫情;田间以散发O型口蹄疫为主。六年间报告牛口蹄疫疫情36次,羊疫情1次,猪疫情17次。分子流行病学研究表明,O/Mya-98、O/Ind-2001、O/CATHAY、O/PanAsia和A/Sea-97这5个流行毒株同时流行,且与同时期周边国家（缅甸、老挝和越南等）口蹄疫毒株遗传关系密切。流行病学调查结果显示,疫情（尤其是牛疫情,占比66.7%）主要发生在流通（57%）、散养（32%）等免疫薄弱环节。【结论】对内强化疫苗免疫和流通动物管控,对外严防境外毒株传入仍是今后中国口蹄疫防控的重要任务。     

Foot and mouth disease virus polyepitope protein produced in bacteria and plants induces protective immunity in guinea pigs

The goal of this project was to develop an alternative foot and mouth disease (FMD) vaccine candidate based on a recombinant protein consisting of efficient viral epitopes. A recombinant gene was designed that encodes B-cell epitopes of proteins VP1 and VP4 and T-cell epitopes of proteins 2C and 3D. The polyepitope protein (H-PE) was produced in E. coli bacteria or in N. benthamiana plants using a phytovirus expression system. The methods of extraction and purification of H-PE proteins from bacteria and plants were developed. Immunization of guinea pigs with the purified H-PE proteins induced an efficient immune response against foot and mouth disease virus (FMDV) serotype O/Taiwan/99 and protection against the disease. The polyepitope protein H-PE can be used as a basis for developing a new recombinant vaccine against FMD.     

共表达PCV2 ORF2和猪IL-18基因的重组猪伪狂犬病毒对小鼠的免疫原性

【目的】研制猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二联活疫苗,并用猪IL-18作为免疫佐剂。【方法】将猪IL-18基因插入到质粒p GO中,获得的重组转移质粒p GO18与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染ST细胞,并进行空斑筛选和纯化;RT-PCR和Western blot分别从转录和蛋白水平鉴定其表达情况。将重组病毒PGO18和PGO、PRV弱毒株HB98、PCV2灭活商品苗和1640细胞培养基分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后二次免疫,二免后4周用PCV2 DF强毒和PRV Min/A强毒接种小鼠。通过ELISA、血清中和试验和流式细胞术及攻毒保护试验评价重组病毒的免疫原性。【结果】获得了重组病毒PGO18,并且可在ST细胞内表达;PGO18可诱导小鼠机体产生PCV2的ELISA和PRV的中和抗体水平,刺激CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群的增殖,且能有效抵抗PCV2和PRV强毒攻击。【结论】IL-18基因可增强重组病毒的免疫效果,使重组病毒具有良好的免疫原性,有望成为防治PCV2和PRV的候选疫苗株。