人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

毕赤酵母GS115表达HSA-GCSFm的诱导工艺研究

本文探讨了甲醇流加控制、添加胰蛋白胨和甲醇/山梨醇共混诱导对重组毕赤酵母GS115/pPIC9K-HSA-GCSFm表达HSA-GCSFm的影响.结果显示:甲醇供应充足条件下HSA-GCSFm表达水平仅为37 mg·L-1,而甲醇添加受限条件下HSA-GCSFm表达水平可达到239mg·L-1;甲醇添加受限并添加胰蛋白胨条件下,HSA-GCSFm表达水平可以提高到266 mg·L-1;在此基础上,流加山梨醇作为辅助碳源,表达水平可大幅提高至424 mg·L-1.通过对各诱导条件下OUR、胞外蛋白酶及碳流分配进行分析后发现,将甲醇限制在低浓度同时添加胰蛋白胨与山梨醇,可以改善细胞代谢活性,增加细胞用于HSA-GCSFm合成的碳流分配量,降低胞外蛋白酶活性,从而提高了HSA-GCSFm的表达水平并缓解了HSA-GCSFm的降解.因此,该诱导工艺适于毕赤酵母高效表达HSA-GCSFm.     

骨形成蛋白10成熟肽在大肠杆菌中的表达纯化及活性分析

目的:以生物制备骨形成蛋白10(BMP10)为目标,研究BMP10成熟肽在大肠杆菌中的表达及活性。方法:以人源BMP10成熟肽基因为模板,PCR获得N端带有组氨酸标签(6×His)的融合基因6×His-m BMP10,构建p ET28a/m BMP10表达载体;热击转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株,卡那霉素抗性筛选获得重组表达菌株BL21/p ET28a-6×His-m BMP10,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳、Western印迹对蛋白进行分析;超声波破碎菌体,收集包涵体,镍柱亲和层析纯化获得电泳纯目的蛋白;透析复性后,非还原SDS-PAGE检验目标蛋白的二聚体形成;通过体外细胞实验检测蛋白活性。结果:纯化得到纯度90%以上的m BMP10,复性后二聚体得率约为40%;活性实验测得P19细胞的Smad6蛋白表达上调3倍左右。结论:通过大肠杆菌表达体系获得具有生物活性的BMP10,为后续作用机理研究奠定了实验基础。     

合欢皮总皂苷急性毒理学研究

本文采用常规急性毒理学研究的方法探究合欢皮总皂苷对小鼠的毒性剂量。HE染色观察其主要器官形态学变化,玻璃毛细管法测定血液凝固时间,生化法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)活性。合欢皮总皂苷的最小致毒量为7.5 mg/kg,近似致死量为1500 mg/kg,半数致死量(LD50)为2164 mg/kg。毒性表现为动物活动减少、1500 mg/kg以上剂量使小鼠食欲下降、2250 mg/kg剂量使小鼠体重明显下降;给药后1 d、7 d和14 d给药组血液凝固时间缩短;主要器官形态学明显改变,明显降低主要器官SOD和GSH-PX活性。结果表明合欢皮总皂苷对小鼠有一定的毒性作用。     

合欢皮提取物抑制血管生成的体内药效学研究

为了探讨合欢皮提取物体内对血管生成的抑制作用。本文采用MTT法和Matrigel plug方法考察合欢皮提取物对人血管内皮细胞(HMEC)增殖和体内Matrigel胶小管形成的影响,运用Lewis肺癌转移小鼠模型,观察合欢皮提取物对小鼠Lewis肺癌的疗效。结果表明合欢皮提取物可明显抑制HMEC细胞的体外增殖(IC50为30μg/mL),并且呈明显的剂量依赖性,同时具有抑制Matrigel plug中的血管新生的作用。合欢皮提取物还能够明显抑制Lewis肺癌肿瘤细胞生长,减少转移病灶。提示合欢皮提取物具有明显抑制血管生成的作用,有可能成为有效的血管生成抑制剂。     

合欢皮提取物抑制血管生成作用的研究

本文采用体外细胞培养法和体内鸡胚尿囊绒膜模型、荷瘤模型检测合欢皮提取物抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)的增殖、迁移活性,观察合欢皮提取物的抑制血管生成情况.发现合欢皮提取物能显著抑制HMEC-1的增殖(IC_(50)为30μg/mL)和迁移,并且呈明显的剂量依赖性.在体内同时具有抑制鸡胚尿囊膜和肿瘤组织中血管生成的作用.     

人乳腺癌多药耐药细胞系MCF-7/MDRa的建立及其生物学特性的初步研究

实验以MCF-7细胞株为亲本细胞,采用阿霉素(ADM)低浓度持续加量诱导法建立了多药耐药的人乳腺癌细胞系MCF-7/MDRa,并对其耐药谱、动力学周期分布、表型变化、药物的蓄积量等生物学特性进行了初步分析评价。结果表明,MCF-7/MDRa细胞较亲本细胞的ADM半数致死浓度(IC50)高500倍,撤药培养150天后耐药指数仍维持在200倍以上,并对多种化疗药物产生交叉耐药性;耐药细胞分化程度低于同步传代的MCF-7细胞,细胞倍增时间与亲本细胞接近,S期细胞显著增加,G1期细胞减少;随着撤药时间的延长,细胞的增殖速度加快;耐药细胞P-gP、LRP和GSTπ的表达水平较亲本细胞有显著增加,ER阳性表达丢失;在稳定生长的撤药培养6天的细胞中仍有ADM蓄积。建立的MCF-7/MDRa模型具有多药耐药细胞的基本生物学特性,可用于肿瘤多药耐药机制的研究。     

荧光定量RT-PCR检测血管内皮细胞PAI-1 mRNA方法的建立

为了建立用荧光定量PCR检测人微血管内皮细胞纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）mRNA表达的方法。提取人微血管内皮细总RNA,经RT-PCR获得靶基因（PAI-1）及管家基因（β-actin）的PCR产物。纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定量PCR检测,建立标准曲线。方法学考核参数为特异性、线性范围、灵敏性和重复性。分析全反式维甲酸对内皮细胞表达PAI-1 mRNA的干预效果。这种定量方法特异性好,检测的灵敏度达10^3拷贝,线性范围为10^4-10^10拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系（r^2〉0.990）,批内变异≤4.93%,批间变异≤9.12%。全反式维甲酸能上调内皮细胞PAI-1 mRNA的表达,且呈剂量依赖性。因此,荧光定量RT-PCR检测血管内皮细胞PAI-1基因表达的方法有助于溶栓药物药理学的研究和新药筛选。     

人胰高糖素样肽-1及其突变体在大肠杆菌BL21中的表达与生物活性研究

以人胰高糖素样肽-1（human glucagons-like peptide-1,GLP-1））为研究对象,以克隆载体pPblu2SKP/（GLP-1A2G）2基因为模板,利用PCR扩增获得GLP-1与其突变体GLP-1A2G的编码基因,并将其插入原核表达质粒pGEX-4T-1中,利用氯化钙法将其转入表达宿主大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达,经IPTG诱导后,收集菌体。菌体经超声破碎后,裂解液用GST亲和层析纯化得到融合蛋白,经凝血酶酶解,用Superdex G-75凝胶层析,得到GLP-1及其突变体GLP-1A2G的样品,经SDS-PAGE电泳测定,样品纯度〉90%。小鼠糖耐量试验表明,相对于空白对照组而言,GLP-1及其突变体GLP-1A2G可以明显地控制血糖的水平,两者的生物活性并无明显差异。由于突变体GLP-1A2G较GLP-1可以更加有效的抵制DPPⅣ的降解,提示突变体GLP-1A2G较GLP-1在白蛋白融合或PEG修饰等方面具有更大的优势。     

两株耐紫杉醇人乳腺癌细胞MCF-7的比较

建立稳定的肿瘤多药耐药(MDR)细胞株是肿瘤MDR机制研究的基础,以MCF-7细胞林为亲本细胞株,采用低浓度加量持续诱导和高浓度短期作用分别建立MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞模型,并对其耐药谱、动力学周期变化、表形变化、细胞侧群分布、药物蓄积等生物学特性比较评价.结果表明,MCF-7/Taxola和MCF-7/Taxolb细胞的紫杉醇(paclitaxel/Taxol)半数抑制浓度(IC50)分别是亲代MCF-7细胞的525倍和330倍,并且都对多种化疗药物交叉耐药;MCF-7/Taxola细胞S期细胞显著增加,G,期细胞减少;MCF-7/Taxolb细胞各个期变化不大;MCF-7/Taxola细胞P-糖蛋白(P-gP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和还原型谷胱甘肽-S转移酶(GSTπ)的表达水平较亲代有显著增加,而MCF-7/Taxolb细胞GSTπ的表达水平较亲代也有显著增加,另外,拓扑异构酶Ⅱ(ToPoⅡ)在两株耐药细胞中表达都明显下降,而两株细胞雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)阳性都表达丢失;光镜下耐药细胞MCF-7/Taxola明显变大并且形态不规则而MCF-7/Taxolb变化不大;电镜下MCF-7/Taxolb表面纤绒毛成小球状隆起和絮状,而MCF-7/Taxolb表面成絮状:MCF-7/Taxola撤药10天后细胞中有紫杉醇蓄积,而MCF-7/Taxolb中没有紫杉醇蓄积.两个模型都具有MDR的基本生物学特性,可用于肿瘤MDR机制的研究,通过两种耐药细胞的比较,推测MCF-7/Taxolb细胞是MCF-7/Taxola细胞的一个亚群.