人血浆蛋白C的分离纯化与鉴定

冰冻人血浆37℃融化后,经钡盐吸附沉淀、硫酸铵分步盐析、DEAE-Sephadex A-50柱层析、制备性PAGE和肝素亲和层析分离,得到蛋白C。经鉴定,所得蛋白C分子量约为62kD,pI为4.69,PAGE分析高度均一,KPTT法证实其延长凝血时间,与有关文献报道相符。     

人血清白蛋白-血管钠肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达

人工合成VNP基因,通过酶连构建HSA和VNP基因的融合基因,插入表达载体pPIC9K,电转至毕赤酵母GS115,构建成工程茵,甲醇诱导表达。重组表达质粒经双酶切验证构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析分子量为69 000 Da,与理论值相符;Western blot鉴定产物兼有HSA和VNP免疫原性,说明其为杂合分子;兔胸主动脉环离体灌流实验证明融合蛋白具有舒张血管活性。本研究说明毕赤酵母适于HSA-VNP融合蛋白的表达,为进一步开发稳定的VNP药物提供了生物制备方法。     

合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞体外增殖的影响

研究合欢皮总皂苷对人微血管内皮细胞增殖的药效学影响。采用人脐静脉微血管内皮细胞HMEC-1作为研究模型,经不同剂量合欢皮总皂苷作用48、72 h后,应用SRB法、光学显微镜观察合欢皮总皂苷对HMEC-1细胞增殖、形态的影响;应用台盼蓝染色法、DNA梯形条带法、流式细胞仪PI单染方法分析合欢皮总皂苷对HMEC-1细胞生长的影响。实验结果发现合欢皮总皂苷提取物具有抑制血管内皮细胞增殖的作用,其与时间、剂量均存在依赖关系,作用48 h的IC50为1.5μg/mL;合欢皮总皂苷使HMEC-1细胞周期阻滞在亚G0/G1期,高剂量作用48 h后可能引起细胞产生坏死。因此,合欢皮总皂苷可能通过改变细胞周期,部分引起细胞坏死,从而抑制人微血管内皮细胞的增殖。     

利用酿酒酵母稳定完整表达融合蛋白hPTH(1-34)ab-HSA

为稳定完整表达人甲状旁腺激素(hPTH)(1-34)二联体与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,以酿酒酵母为宿主,利用重叠PCR技术,将α-factor基因拼接到hPTH(1-34)ab-HSA基因片段上,获得α-hPTH(1-34)ab-HSA,并插入穿梭表达质粒pYX212,构建了基因工程菌S.cerevisiae W303-1A/pYX-α-hPTH (1-34)ab-HSA.经Western blot分析及N端氨基酸测序表明,该工程菌表达分泌了具有HSA和hPTH抗原性的完整hPTH(1-34)ab-HSA融合蛋白,解决了毕赤酵母不能稳定完整表达融合蛋白hPTH(1-34) ab-HSA的问题.     

重组胰高糖素样肽-1融合蛋白的纯化及其活性测定

主要探讨了发酵液中融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA的分离纯化过程。发酵上清液经超滤浓缩、离子交换层析、凝胶过滤分离得高纯度的rh（GLP-1A2G）2-HSA。纯化样品经SDS-PAGE检测为单一条带,HPLC分析纯度达98%,^125I标记后用TCA沉淀法测定放射性纯度达97%,符合药效学和药代动力学研究的需要,整个纯化过程回收率达到48.5%。通过细胞增殖实验表明纯化后的rh（GLP-1A2G）2-HSA具有类似GLP-1的促胰岛β细胞增殖活性,说明该分离过程保护了融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA的生物活性。通过融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA的纯化方法,可获得高纯度的重组融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA,为进一步的药效学和药代动力学研究奠定了基础。     

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut 转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.     

氯霉素全抗原的合成及鉴定

为建立氯霉素的免疫分析方法,采用混合酸酐法和重氮化法,将半抗原氨霉素(CAP)与载体牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原CAP-BSA和包被抗原CAP-OVA.以紫外扫描确定偶联率,并用酶联免疫(ELISA)的方法鉴定,确定偶联成功.经过比较,混合酸酐法优于重氮化法.     

人b干扰素与人血清白蛋白融合蛋白的表达及纯化

为开展人β干扰素-人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HAS)的临床前研究,本研究采用免疫学方法对毕赤酵母转化子进行筛选,得到高产菌株8株。在5L发酵罐上对高产菌株进行诱导表达,产量达500mg/L。发酵液经超滤浓缩、染料亲和层析、镍离子螯合亲和层析和DEAE离子交换层析纯化后,融合蛋白纯度达到96%。Westernblotting杂交表明融合蛋白具有人血清白蛋白和人β干扰素的抗原性,细胞病变抑制法测定IFNβ-HSA比活性为1.96×107IU/mg。建立了融合蛋白的生产工艺,为IFNβ-HSA的临床前研究奠定了基础。