一种展示SARS冠状病毒受体结合区的重组枯草杆菌芽孢的制备及免疫原性分析

目的：利用枯草杆菌芽孢呈递技术制备表达SARS冠状病毒S蛋白受体结合区（RBD）的重组芽孢。方法：将枯草杆菌 CotB 基因构建到基因组整合质粒pDG1664中,再将 RBD 基因连接到 CotB 基因的下游,构建成重组质粒pDG1664-CotB-RBD,通过同源重组整合到PY-79枯草杆菌基因组中;利用红霉素抗性筛选重组菌并进行PCR和DNA测序鉴定,Western印迹鉴定重组菌芽孢表面RBD蛋白的表达情况;用表达RBD的重组芽孢以口服方式免疫小鼠,通过ELISA和流式细胞术检测重组芽孢的免疫原性。结果：制备出枯草杆菌基因组整合了RBD抗原基因的重组菌株RS1931,形成的重组芽孢表达相对分子质量约62×103的CotB-RBD融合蛋白;重组芽孢免疫的小鼠血清RBD抗原特异性IgG抗体滴度在末次免疫后2周可达1∶10880,重组芽孢初免后18周的小鼠脾细胞中IFN-γ＋CD4^＋、IL-4＋CD4^＋和IFN-γ＋CD8^＋T细胞比例上调,表明重组芽孢经口服免疫产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。结论：针对SARS冠状病毒S蛋白RBD建立了枯草杆菌芽孢呈递技术方法,制备出在枯草杆菌芽孢表面稳定表达外源RBD蛋白的重组株,获得的重组芽孢具有良好的免疫原性,为开发芽孢呈递型SARS疫苗奠定了基础。     

Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂的制备及光动力杀伤效应研究

目的:制备Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂,通过体外实验探讨其介导的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)特异性杀伤肿瘤细胞效果。方法:以单油酸甘油酯(glyceryl monooleate,GMO)和泊洛沙姆407(poloxamer 407,P407)为液晶材料,以光敏剂Photosan为模型药物,制备Photosan立方液晶纳米粒,通过Malvern粒径仪和扫描电子显微镜等考察其理化性质;通过MTS法考察Photosan立方液晶纳米粒对正常肝细胞株和肝癌细胞株的暗毒性及光动力杀伤效果。结果:成功制备Photosan脂质立方液晶纳米粒,该纳米粒对人肝L-02细胞和人肝癌Hep G2细胞均没有暗毒性,其介导的PDT对人肝L-02细胞增殖有一定抑制作用[细胞抑制率为(32.9±1.19)%],而对肝癌Hep G2细胞增殖具有更显著的抑制作用[细胞抑制率为(77.9±2.06)%];Photosan立方液晶介导的光动力作用对人正常肝细胞的增殖抑制作用低于Photosan,但对肝癌细胞的增殖抑制作用高于Photosan。结论:Photosan脂质立方液晶纳米粒对人正常肝细胞安全性较好,对肝癌细胞的光动力杀伤效应明显优于Photosan,为光动力治疗癌症提供了创新性方法。     

基于Loxp-Cre系统的FBXL15基因敲除小鼠模型的建立

建立FBXL15基因条件型敲除小鼠模型,为研究该基因所发挥的重要生理功能提供材料和思路。采用KO first策略,构建打靶载体,将1st loxP插入1~2号内含子,在3~4号内含子之间插入FRT-SAIRES-lacZ-loxP-neo-loxP元件,通过Long Range PCR及Southern blot筛选出中靶克隆,随后进行囊胚注射,并将发生同源重组的ES细胞注射进C57BL/6J小鼠囊胚,移入受体小鼠子宫,最后将得到的嵌合体雄鼠与C57BL/6J雌鼠交配获得FBXL15-LoxP小鼠。PCR结果显示FBXL15的Loxp小鼠模型构建成功,该模型可为进一步研究FBXL15在胚胎发育和骨代谢中的调控作用提供工具。     

多肽抗体检测原发性肝癌血清标志物ELISA方法的建立及应用

血清多肽是癌症诊断信息的重要来源,建立、优化了检测多肽标志物的直接ELISA法,并应用于肝癌血清中的多肽标志物的检测。制备及纯化针对多肽标志物Pep5的单克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,用其建立检测相应抗原的直接ELISA法。方法线性范围为1.5-20 ng/mL,检测限为1.24 ng/mL;标准品批内及批间CV分别小于3.66%及4.89%,血清样本批内及批间CV分别小于11.69%及18.18%;线性范围内(9、12和15 ng/mL)的回收率分别为98.98%,99.61%和101.58%。应用该方法共检测160例正常血清、104例肝硬化及156例肝癌患者血清,正常组与肝硬化组及肝癌组间差异显著(P<0.001),Pep5诊断肝癌的敏感性和特异性分别为80.8%和96.2%。同时检测94例HCC血清中的AFP和Pep5,AFP检出率为63.8%,Pep5检出率为90.4%,AFP联合Pep5检测时,能将HCC的检出率提高至94.7%。     

酪胺信号放大-量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法的建立

目的:建立一种酪胺信号放大-量子点标记银染增强的基因芯片可视化检测方法,提高基因芯片检测的灵敏度。方法:待测靶基因与固定在玻片上的探针杂交,依次加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶、生物素标记的酪胺及链霉亲和素标记的量子点,37℃孵育,然后加入银增强试剂显色,最后用可视化生物芯片扫描仪扫描并记录结果;以牛布鲁菌210105株为检测对象,以酪胺信号放大-荧光素Cy3(TSA-Cy3)检测法为对照方法,测定酪胺信号放大-量子点标记银染增强(TSA-QDS)检测法的灵敏度。结果:确定了基因芯片量子点标记银染增强可视化检测方法的检测流程,优化了检测条件,并考察了检测灵敏度。优化的检测条件为:酪胺-生物素稀释比例为1∶4000,链酶亲和素标记的量子点稀释比例为1∶50,37℃孵育时间为25~30 min,银染增强时间为6~7 min。检测牛布鲁菌的灵敏度为103CFU/mL。结论:该方法实现了基因芯片高灵敏度可视化检测,其灵敏度与荧光法相当,并且有可视化的优势。     

适度低氧对脑损伤的保护作用

低氧是一把双刃剑,剧烈持续的低氧能对机体造成损害,而温和短暂的低氧却能给机体带来有益的作用。适度低氧或间歇性低氧训练通过非损伤性刺激,激活机体产生保护作用。低氧预适应或低氧训练是国内外公认的抗低氧损伤干预的重要手段。近年来,越来越多研究显示适度低氧对脑缺血、神经退行性疾病及精神疾病都有预防和治疗作用。本文就适度低氧对脑相关疾病的保护作用及其调节机制进行总结,以期为临床脑相关疾病的治疗和预防提供一个新的手段和策略。     

血管内皮生长因子全长抗体在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL,评价其在毕赤酵母中的表达产物与抗原的结合特性,及其抑制细胞增殖的活性。方法:利用基因合成分别获得VEGF抗体CL和CH序列,分别构建pPICZαA-CH和pPICZαA-CL重组质粒,再利用同尾酶特性构建双启动子表达盒的重组pPICZαA-CH-CL载体,用Westen印迹对其进行表达鉴定后将VH和VL序列插入该载体,获得VEGF的全长抗体表达载体pPICZαA-VH-CH-VL-CL;通过膜筛和ELISA进行菌株筛选,并对VEGF抗体表达阳性菌株进行小量表达和纯化,采用CCK-8法对其抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的活性进行初步评价。结果:获得表达轻、重链的VEGF抗体表达载体,ELISA实验证明pPICZαA-VH-CH-VL-CL具有一定的VEGF抗原结合特性;体外增殖实验表明,该抗体可以以剂量依赖性抑制HUVEC增殖。结论:在毕赤酵母中表达、纯化了具有一定功能活性的VEGF全长抗体,为后续比较研究酵母糖基化改造对VEGF抗体的药效学和药代学的影响提供了基础。     

支架蛋白GIT2通过与Smad3相互作用调节其转录活性

G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白2(G protein-coupled receptor kinase interacting proteins 2,GIT2)是一种信号支架蛋白,可募集多种信号通路的关键分子,参与肌动蛋白细胞骨架组装、整合素介导的细胞粘附、G蛋白偶联受体的内化及胞内信号传递等生物学过程. 采用酵母双杂交实验证明,TGF-β1信号通路的转录因子Smad3是GIT2的相互作用蛋白质,内、外源免疫共沉淀实验均证实,GIT2与Smad3存在蛋白质相互作用. 报告基因实验及免疫印迹结果表明,GIT2增加Smad3的转录活性并增强TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化.研究还发现,Git2-/-小鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的Smad3磷酸化受到抑制,其骨形成相关靶基因的表达水平也低于Git2+/+小鼠. 本研究表明,GIT2通过与Smad3的相互作用调节其转录活性并活化TGF-β1信号通路,可能参与调节骨髓间充质干细胞的分化.     

体外筛选诱导人脐带间充质干细胞分化的微生物代谢物

为了筛选出能够诱导hUC-MSCs成脂或成骨分化的微生物代谢物,将hUC-MSCs接种于96孔板中,并加入代谢物筛选样品,通过观察细胞形态学变化,以及油红染色、碱性磷酸酶染色鉴定hUC-MSCs的成脂、成骨分化。从446种微生物代谢物中筛选出一种具有明显诱导hUC-MSCs成脂分化的微生物代谢物。